牙釉質(zhì)基因Y片段缺失親子鑒定1例

任蘋 林琳 吳淑珍

[摘要]目的通過(guò)對(duì)親權(quán)關(guān)系中牙釉質(zhì)基因 Y 片段缺失的案例進(jìn)行報(bào)道，分析其對(duì)親子鑒定中結(jié)果的影響及解決方法。方法采用聚苯乙烯二乙烯基苯樹(shù)脂（chelex）法提取被鑒定人樣本的 DNA，使用 AGCU EX22與 AGCU Database Y24人類熒光標(biāo)記 STR 復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑進(jìn)行復(fù)合 PCR 擴(kuò)增，使用 ABI-3500遺傳分析儀電泳檢測(cè)，使用GeneMapper? ID-X 1.5軟件分析結(jié)果。結(jié)果結(jié)果顯示子的牙釉質(zhì)基因擴(kuò)增 Y 片段缺失，僅檢測(cè)到Amel-X，系染色體片段Amel-Y 缺失所致，本次檢測(cè)的所有 STR 基因座均進(jìn)行多次檢驗(yàn)，并排除污染的可能性。結(jié)論在親子鑒定中如遇到Amel-Y 缺失時(shí)，應(yīng)綜合分析檢驗(yàn)結(jié)果，并增加試劑盒檢驗(yàn)，避免結(jié)果中對(duì)被鑒定人性別的誤判，本案例報(bào)道為親子鑒定領(lǐng)域中Amel-Y 缺失的案件，提供了一定的參考思路及解決方法。

[關(guān)鍵詞]法醫(yī)物證學(xué);親子鑒定; Y 染色體基因缺失;牙釉質(zhì)基因

[中圖分類號(hào)] D919.4? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A?? [文章編號(hào)]2095-0616（2021）24-0237-04

A case of Y segment deletion of enamel gene in paternity test

REN? Ping??? LIN? Lin??? WU? Shuzhen

Department of Forensic Material Evidence， Wenzhou Medical University Forensic Center， Zhejiang， Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the impacts of Y segment deletion of enamel gene in the results of paternity test and its solutions， its case was reported in this paper. Methods The method of polystyrene divinylbenzene resin （chelex） was used to extract the DNA of the identified human samples， and the compound PCR was carried out by using AGCU EX22 and AGCU Database Y24 human fluorescence labeled STR compound amplification detection reagent. Electrophoresis was performed by using ABI-3500 genetic analyzer， and the results were analyzed by using GeneMapper? ID-X 1.5 software. Results The results showed that the amplification of enamel gene in the offspring resulted in the deletion of Y segment， and only Amel-X was detected in the sample， which was caused by the deletion of Amel-Y chromosome segment. All STR loci detected this time were tested for many times， and the possibility of contamination was ruled out. Conclusion In case of Amel-Y deletion in paternity test， the test results shall be comprehensively analyzed， and the kit test shall be increased to avoid misjudgment of the identified gender in the results. This case report provides some reference ideas and solutions for the case of Amel-Y deletion in the field of paternity test.

[Key words] Forensic material evidence; Paternity test; Y chromosome gene deletion; Enamel gene

性別鑒定是法醫(yī)鑒定的一個(gè)重要步驟，特別是在強(qiáng)奸案件及燒焦腐爛尸體或其他偵破刑事案件時(shí)，而Amelogenin基因的擴(kuò)增是性別鑒定的重要方法，已被廣泛應(yīng)用在法醫(yī)案件的偵破過(guò)程中[1-4]。而在親子鑒定中，Amelogenin基因的應(yīng)用尤為廣泛，目前它包含在多種常染色體 STR 檢測(cè)的試劑盒中，如 AGCU EX22、AGCU 21+1人類熒光標(biāo)記 STR 復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）、SifaSTR23人類熒光標(biāo)記 STR 復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究院）等。盡管目前使用Amelogenin基因的試劑盒相對(duì)成熟，但是由于 Y 染色體釉原蛋白區(qū)域的缺失率高于 X 染色體，導(dǎo)致Amel-Y 擴(kuò)增的準(zhǔn)確性不高，極易造成性別的誤判[5-6]，因此，本文通過(guò)報(bào)道Amel-Y 缺失的一個(gè)特殊案例，為法醫(yī)案件中涉及的性別鑒定及在日常的親子鑒定中，遇到Amel-Y 缺失時(shí)，提供了一定的參考思路及解決方法，從而避免造成性別誤判，提高鑒定意見(jiàn)的準(zhǔn)確性。

1案例

1.1簡(jiǎn)要案情

因辦理出生證明簽發(fā)需要，母攜帶一男孩要求鑒定，母委托本中心對(duì)母與子之間親權(quán)關(guān)系進(jìn)行鑒定。兩名被鑒定人無(wú)輸血、骨髓移植及放化療史等。男孩外觀正常，男性特征明顯，身份證信息顯示為男性。按照知情同意原則，采集了被鑒定人的血樣。

1.2檢驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取用聚苯乙烯二乙烯基苯樹(shù)脂（chelex）法提取所有檢材 DNA[7]。

1.2.2人類 DNA 性別及 STR 多態(tài)性分析取所有檢材 DNA 適量，采用 AGCU EX22（批號(hào)：1805071）及 AGCU Database Y24（批號(hào)：1809141）人類熒光標(biāo)記 STR 復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行復(fù)合 PCR 擴(kuò)增， AGCU EX22及 AGCU Database Y24試劑盒擴(kuò)增體系：Primer 2.0?l，Reaction Mix 4.0?l，Taq （5 U/?l）0.4?l，H2O 1.6?l，模板 DNA 2.0?l，總體積10.0?l。

AGCU EX22試劑盒擴(kuò)增條件：95℃保溫2 min →94℃30 s，60℃1 min，72℃1 min，循環(huán)10次→ 90℃30 s，58℃1 min，72℃1 min，循環(huán)20次→ 60℃延伸60 min，4℃維持; AGCU Database Y24試劑盒擴(kuò)增條件：95℃保溫2 min →94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，循環(huán)10次→90℃1 min，58℃1 min，72℃1 min，循環(huán)20次→60℃延伸60 min，4℃維持。擴(kuò)增產(chǎn)物在 ABI-3500遺傳分析儀上進(jìn)行電泳檢測(cè)，采用GeneMapper? ID-X 1.5軟件分析結(jié)果。1.2.3數(shù)據(jù)處理按照中華人民共和國(guó)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布的《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T 37223-2018）規(guī)定的相關(guān)參數(shù)計(jì)算方法，運(yùn)用《數(shù)據(jù)處理作業(yè)指導(dǎo)書(shū)》（WYDSF-ZY-WZ-03-2018）的常染色體 STR 基因座等位基因分布頻率數(shù)據(jù)，計(jì)算相關(guān)親權(quán)指數(shù)（PI 值）與累積親權(quán)指數(shù)（CPI 值）。

1.3檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T37223-2018）第8條：累積親權(quán)指數(shù)<0.0001時(shí)，支持被檢測(cè)男子（或被檢測(cè)女子）不是孩子生物學(xué)父親（或母親）的假設(shè)。累積親權(quán)指數(shù)>10000時(shí)，支持被檢測(cè)男子（或被檢測(cè)女子）是孩子生物學(xué)父親（或母親）的假設(shè)。

在本案例中，經(jīng) AGCU EX22試劑盒常染色體 STR 檢驗(yàn)，子在21個(gè)常染色體 STR 基因座的等位基因可從母的基因型中找到來(lái)源（圖1、表1），經(jīng)計(jì)算，累積親權(quán)指數(shù)為3280136031.2005（表1），支持母為子的生物學(xué)母親。其中子的Amelogenin（牙釉質(zhì)蛋白）基因座上僅檢測(cè)到Amel-X，X 片段的峰值與正常雜合子峰值近似，為相鄰基因座純合子峰值的一半（圖2），未檢出 Y 片段。傾向于認(rèn)為是：子的牙釉質(zhì)基因擴(kuò)增Amel-Y 缺失。進(jìn)一步對(duì)子的樣本進(jìn)行 Y-STR 分析，用 AGCU Database Y24試劑盒檢出 Y-STR 分型（表2），證明子的性染色體中包含有 Y（圖3）。本次檢測(cè)的所有 STR 基因座均進(jìn)行多次檢驗(yàn)，并排除污染的可能性。

2討論

Amel-X 和Amel-Y 是編碼牙釉蛋白Amelogenin的一對(duì)等位基因，分別位于人類的 Xp22.1-Xp22.3（2872 bp）和 Yp11.2（3272 bp）[8-11]。通過(guò)設(shè)計(jì)引物，覆蓋 X 或 Y 染色體該基因內(nèi)含子或者外顯子內(nèi)不同的缺失，可得到長(zhǎng)度不同的 X 和 Y 的 PCR 產(chǎn)物，利用長(zhǎng)度差異進(jìn)行性別鑒定[11]。目前最常使用的特異性 PCR 引物是由英國(guó)法庭科學(xué)服務(wù)部（Forensic Science Service， FSS）設(shè)計(jì)的，PCR 同時(shí)擴(kuò)增 X 和 Y 染色體可獲得106 bp 和112 bp 的產(chǎn)物，正常情況下電泳結(jié)果顯示女性個(gè)體為1條譜帶（XX），男性個(gè)體為2條譜帶（XY）[12-14]。

Amelogenin Y 丟失時(shí)，僅檢出Amel-X，Amel-Y 為陰性，有可能導(dǎo)致男性樣本檢見(jiàn)女性分型，造成性別誤判，很有可能擾亂對(duì)刑事案件犯罪嫌疑人的偵查方向[15]。在本案例中，子常染色體 STR 基因座分型在Amelogenin基因座中顯示為女性分型結(jié)果特征，與委托人提交的身份信息不符。通過(guò)對(duì)子的血樣 DNA 進(jìn)行 Y24檢測(cè)，并得出其 Y-STR 全部基因分型，確定子性別為男性。在子Amelogenin（牙釉質(zhì)基因）基因座上僅檢出Amel-X，傾向于認(rèn)為是在擴(kuò)增過(guò)程中子的牙釉質(zhì)基因Amel-Y 缺失。

一般而言，等位基因丟失概括有兩種情況，一種是由于 PCR 體系在擴(kuò)增過(guò)程中本應(yīng)存在的等位基因由于引物的設(shè)計(jì)、PCR 的循環(huán)退火溫度、 PCR 抑制物等因素影響下導(dǎo)致 STR 分型本應(yīng)為雜合子而錯(cuò)誤的顯示為純合子，另一種情況在堿基（AUTG）配對(duì)過(guò)程中出現(xiàn)配對(duì)錯(cuò)誤或者嚴(yán)重基因缺失[16-17]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，精子是由許多 Y 染色體的特定基因調(diào)控而產(chǎn)生，這些基因大多是在人類 Y 染色體長(zhǎng)臂的一個(gè)特定區(qū)域，被稱為無(wú)精子癥因子區(qū)域（azoospermia factor， AZF），AZF 區(qū)域有很多與精子生成相關(guān)的關(guān)鍵基因位點(diǎn)，其微缺失與男性的不育有關(guān)，而在日常法醫(yī)物證鑒定過(guò)程中，如遇到 Y 染色體基因缺失時(shí)，可以告知被鑒定人，并且建議其去做進(jìn)一步的臨床相關(guān)檢查[18-19]。

在日常法醫(yī)物證鑒定過(guò)程中，尤其在刑事案件中，遇到遺留在犯罪現(xiàn)場(chǎng)嫌疑人的生物樣本，經(jīng)常規(guī) DNA 分型、Amelogenin基因檢驗(yàn)，如果被鑒定人的Amelogenin基因檢驗(yàn)結(jié)果顯示為“X”，表型性別卻為“男”時(shí)。則會(huì)因其基因檢測(cè)結(jié)果顯示是“女”而將偵查方向指向女性群體，使這種表型為“男”的個(gè)體被排除在犯罪嫌疑人范圍之外[20]。Y 染色體Amelogenin缺失則可能導(dǎo)致 Y 染色體擴(kuò)增失敗，無(wú)法得到相應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物，從而使男性樣本可誤判女性。遇到類似案件可以通過(guò) Y-STR 檢測(cè)分型或擴(kuò)增男性性別決定區(qū)（sex-determining region Y，SRY） 來(lái)確認(rèn)被檢測(cè)者是否為男性[21-22]。因此在司法鑒定與刑事案件中，如果遇到Amelogenin Y 缺失的案例，基因檢測(cè)結(jié)果與影像資料或者案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)見(jiàn)證人員的描述不符合時(shí)，建議采取其他廠家的常染色體試劑盒或者性別試劑盒進(jìn)行多次驗(yàn)證，進(jìn)一步確定性別，以確保鑒定意見(jiàn)的準(zhǔn)確性。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Pouchkarev VP，Shved EF，Novikov PI.Sex determination of foresic of forensic samples by polymerase chain reaction of the amelogenin gene and analysis by capillary electrophoresis with polymer matrix[J].Electrophoresis，1998，19（1）：76-79.

[2]Roffey PE，Eckhoff CI，Kuhl JL.A rare mutation in the amelogenin gene and its potential investigative ramifications[J].Journal of Forensic Sciences，2000，45（5）： 1016-1019.

[3]Akane A，Seki S，Shiono H，et al.Sex determination of forensic samples by dual PCR amplification of an X-Y homologous gene[J].Forensic Sci Int，1992，52（2）：143-148.

[4]Sullivan KM，Mannuci A，Kimpton CP，et al.A rapid and quantitative DNA sex test： Fluorescence-based PCR analysis of X-Y homologous gene amelogenin[J]. BioTechniyues，1993，15（4）：636-638，640-641.

[5]Dash Hirak R，Rawat Neha，Das Surajit.Alternatives to amelogenin markers for sex determination in humans and their forensic relevance[J].Mol Biol Rep，2020，47：2347-2360.

[6]王克杰，郭利偉，黃艷梅.Amelogenin基因遺傳變異及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2020，35（4）：422-425，421.

[7]Walsh PS，Metzger DA，Higuchi R.Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J].Biotechniques，1991，10（4）：506-513.

[8]Bailey DM，Affara NA，F(xiàn)erguson-Smith MA.The X-Y homologous gene amelogeninmaps to the short arms of both the X and Y chromosomes and is highly conserved in primates[J].Genomics，1992，14（1）：203-205.

[9]Nakahori Y，Hamano K，Iwaya M，et al. Sex identification by polymerase chain reaction using X-Y homologousprimer[J].American Journal of Medical Genetics，1991，39（4）：472-473.

[10]Nakahori Y，Takenaka O，Nakagome Y.A human XY homologous region encodes "amelogenin"[J].Genomics，1991，9（2）：264-269.

[11]黃江平，楊帆，劉亞楠，等.性別鑒定中amelogenin基因座變異的研究進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（5）：371-377.

[12] Zhang Suhua，Tian Huaizhou，Wu Jun，et al.Correction： A New Multiplex Assay of 17 Autosomal STRs and Amelogenin for Forensic Application[J].PLoS One，2019，14：e0217892.

[13]畢潔，暢晶晶，余純應(yīng).疑似Amelogenin等位基因丟失的檢測(cè)與分析12例[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2018，34（4）：396-400.

[14]陳愛(ài)萍，陳勇，王會(huì)品，等.中國(guó)人群Amelogenin基因的突變頻率和突變類型[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2007（6）：615-619.

[15]郝世誠(chéng)，楊雪，石美森，等.46，XY 單純性腺發(fā)育不全法醫(yī)學(xué)鑒定2例[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2019，35（2）：261-263.

[16]呂國(guó)權(quán)，宋健文，古小玉.1例親子鑒定中 Y 染色體基因座缺失案例分析[J].法制博覽，2019（16）：159-160.

[17]徐志成，陳新星，楊曉波，等.Y 染色體14個(gè) Y-STR 等位基因缺失[J].刑事技術(shù)，2020，45（4）：438-440.

[18]陳晴晴，李少英，冼嘉嘉，等.PCR 熒光探針?lè)ㄔ?Y 染色體微缺失檢測(cè)中的應(yīng)用[J].分子診斷與治療雜志，2018，10（4）：257-261，277.

[19]王躍力，葉峻杰，李宗芳，等.對(duì)法醫(yī)學(xué)相關(guān)的 DYS549、DYS527和 DYS459基因座在男性不育癥人群中的缺失、重復(fù)調(diào)查[J].遺傳，2014，36（8）：786-792.

[20]梁燕，梁鰍雙，翚蕓，等.牙釉質(zhì)蛋白基因 Y 缺失1例[J].刑事技術(shù)，2014（3）：56-57.

[21]洪強(qiáng)，薛佳，陶莉，等.Y 染色體 DNA 分型異常2例[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（1）：64-65.

[22]John MB.Forensic DNA typing： Biology，technlogy and genetics of STR markers[M].Amsterdam：Elsevier，2005：688.

（收稿日期：2021-07-29）