邱皓璞 張弛 王曉麗 朱榮
摘 要:以日化產(chǎn)品作為檢測(cè)對(duì)象,以QB/T 2738-2012中對(duì)日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的檢驗(yàn)方法為基礎(chǔ),通過ATP發(fā)光法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中懸液定量法的對(duì)比,對(duì)ATP發(fā)光法在快速檢測(cè)日化產(chǎn)品的抗菌抑菌性的應(yīng)用上的可行性及準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。為國家對(duì)日化產(chǎn)品的監(jiān)管提供新技術(shù)支持。
關(guān)鍵詞:ATP發(fā)光法,快速檢測(cè),日化產(chǎn)品,抗菌抑菌性
在輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2738-2012中規(guī)定了日化產(chǎn)品中抗菌抑菌性的檢測(cè)方法:懸液定量法和抑菌環(huán)法。但這兩種方法都存在弊端,懸液定量法是利用細(xì)菌懸液進(jìn)行常規(guī)微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行計(jì)數(shù),耗時(shí)較長(zhǎng)。抑菌環(huán)法則是使用量取抑菌環(huán)大小的方法來測(cè)定產(chǎn)品中的微生物指標(biāo),容易受外界影響,結(jié)果準(zhǔn)確性低。
三磷酸腺苷(ATP)是一種存在于活著的所有生物細(xì)胞中的化學(xué)物質(zhì),活菌中含有一定量的ATP,如1個(gè)革蘭氏陽性菌的ATP含量約為1*10-18 g,革蘭氏陰性菌是陽性菌的10倍,而酵母又是革蘭氏陰性菌的10倍。ATP、熒光素、氧氣,在Mg2+存在的條件下與熒光素酶發(fā)生反應(yīng),進(jìn)行發(fā)光。
由于其發(fā)光量根據(jù)ATP量的比例進(jìn)行,因此可以通過測(cè)定發(fā)光量來測(cè)定生物由來的ATP量,其檢出限在細(xì)菌數(shù)102~103 cfu/mL。有研究表明ATP發(fā)光量與活菌數(shù)之間有較好的線性關(guān)系,且其在細(xì)胞死亡后極易降解的特性,使其成為較好的活菌的檢測(cè)指標(biāo)。目前ATP發(fā)光法已經(jīng)在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于在牛乳、豆腐等無細(xì)胞食品和水質(zhì)、工作臺(tái)面等環(huán)境中活菌的檢測(cè)。因此,在日化產(chǎn)品的抗菌抑菌性檢測(cè)方面的應(yīng)用也值得期待。
材料與方法
1 儀器與材料
1.1主要儀器:3MTMClean-TraceTMATP熒光檢測(cè)系統(tǒng)(3M公司),3MTMClean-TraceTMATP水質(zhì)采樣棒(3M公司)
1.2其它儀器及試劑:高壓滅菌鍋(TOMY SX-700)、生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠SPX-250B-Z型MODEL SPX-250B-Z)、旋渦混合器、一次性滅菌平皿、1000μl,200μl移液槍及滅菌槍頭、 營養(yǎng)肉湯(北京陸橋)、營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋)。
1.3實(shí)驗(yàn)菌種:大腸桿菌(E.coil) ATCC 25922(American type culture collection)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)ATCC 6538(American type culture collection)
1.4檢驗(yàn)樣品來源:來自市場(chǎng)的不同品牌和種類的洗手液,洗滌劑,洗潔精等產(chǎn)品如寶潔,白貓,聯(lián)合利華,雕牌,浪奇,綠傘,滴露,威露士,汰漬,藍(lán)月亮,奧妙,超能,花王,奇強(qiáng),舒膚佳,六神等著名日化品牌的產(chǎn)品。
2 方法
2.1 ATP發(fā)光法檢測(cè)與懸液定量法的關(guān)聯(lián)性判定
通過ATP熒光檢測(cè)儀測(cè)定不同稀釋梯度的菌種懸液,并將各組數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計(jì)。再將繼續(xù)稀釋至一定范圍的菌種懸液用懸液定量法,36℃,48h培養(yǎng)后計(jì)算CFU值,與ATP發(fā)光值進(jìn)行對(duì)比。
2.2 ATP發(fā)光檢測(cè)方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比試驗(yàn)
行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)具體方法參照QB/T 2738-2012中的懸液定量法,制備細(xì)菌繁殖體懸液,用合適的中和試劑稀釋菌種懸液樣品,與待測(cè)樣品反應(yīng)后,稀釋至相應(yīng)的濃度,倒入培養(yǎng)基,同時(shí)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過37℃,48h培養(yǎng)后,對(duì)平板上形成 的單菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)(cfu/mL)。
ATP發(fā)光法檢測(cè)一定濃度的菌種懸液,加入待測(cè)抗菌抑菌產(chǎn)品,反應(yīng)與懸液定量法相同時(shí)間,將ATP水質(zhì)采樣棒放入試管中取樣,用ATP熒光檢測(cè)儀進(jìn)行讀取數(shù)據(jù)。
3 數(shù)據(jù)處理與分析
將菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)得的值及ATP方法測(cè)得值,按照(消毒前菌液濃度-消毒后菌液濃度)/消毒前菌液濃度,得出抑菌抗菌率。將行標(biāo)方法計(jì)算的抑菌抗菌率與ATP方法計(jì)算的殺菌率進(jìn)行pearson相關(guān)系數(shù)的計(jì)算。當(dāng)p值<0.05,則判斷2個(gè)方法的值相關(guān),ATP發(fā)光法具有可行性,反之則無可行性。
結(jié)果
1 ATP發(fā)光法檢測(cè)與懸液定量法的關(guān)聯(lián)性判定
ATP發(fā)光值與活菌菌落數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如fig.1和fig.2所示,菌液在1*103~9*105cfu/mL濃度范圍內(nèi),無論E.coil(R2=0.9999)還是S. aureus(R2=0.9998)
2 ATP快速檢測(cè)法與懸液定量法計(jì)算抗菌抑菌性值對(duì)比
結(jié)果見表1。ATP發(fā)光方法計(jì)算的殺菌率的值與懸液定量法計(jì)算的值進(jìn)行比較,peason相關(guān)系數(shù)分別為0.998(E.coil)和0.999(S. aureus),p值分別為0.000和0.000,小于0.05,表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性。
討論
3MTMClean-TraceTM ATP熒光檢測(cè)系統(tǒng)的有效菌液測(cè)定范圍在1*103~9*105cfu/mL,比傳統(tǒng)的ATP發(fā)光法測(cè)定的值相比,測(cè)定值與測(cè)定范圍都較低,這應(yīng)該與水質(zhì)采樣棒的采樣方法相關(guān)。但與傳統(tǒng)的ATP方法相同,運(yùn)用ATP快速檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行抗菌抑菌性的檢測(cè)與懸液定量法得到的結(jié)果具有較高的相關(guān)性(p=0.000)。這是因?yàn)锳TP快速檢測(cè)系統(tǒng),雖然在菌液濃度的有效測(cè)量范圍上比ATP傳統(tǒng)方法測(cè)得值低且范圍小,但由于抗菌抑菌性的計(jì)算方式,因此在運(yùn)用ATP快速檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量抗菌抑菌性時(shí),并不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。且在檢測(cè)時(shí)間上ATP快速檢測(cè)系統(tǒng)可以在1分鐘內(nèi)完成抗菌抑菌性的檢測(cè),比傳統(tǒng)的ATP發(fā)光法更加快速,而傳統(tǒng)的懸液定量法至少需要48小時(shí)。在檢測(cè)方法上, ATP快速熒光檢測(cè)系統(tǒng)也比懸液定量法更為簡(jiǎn)便,可以同時(shí)進(jìn)行大批量的檢測(cè),而懸液定量法由于操作上的局限性,步驟更為繁瑣,也無法同時(shí)進(jìn)行大批量操作。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,ATP 生物發(fā)光法比傳統(tǒng)的懸液定量法更為快速、方便,可以應(yīng)用于日化產(chǎn)品抗菌抑菌性的快速檢測(cè)領(lǐng)域。
參考文獻(xiàn):
1) QB/T 2738-2012日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評(píng)價(jià)方法 [ S]
2)増?zhí)镄抟?健康と食の安全を考えた食品衛(wèi)生學(xué)実験[M].2013.:24.
3)Hattori N.,Sakakibara T., Igarashi T.,et al.Enhanced Microbial Biomass Assay Using Mutant Luciferase Resistantto Benzalkonium Chloride[J]. Anal. Biochem.,2003,319,287-295
4) 連英姿,安靜,李越等.ATP生物發(fā)光法快速測(cè)定生乳中細(xì)菌總數(shù)的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志.2009.19(4):839-840.
5)Kong R.Y.C., Lee S.K.Y., Law T.W.F., et al. Rapid detection of six types of bacterial pathogens in marine waters by multiplex PCR[J]. Water Research,2002,36:2802-2812
6)Renaud Chollet, Sébastien Ribault. Bioluminescence – Recent Advances in Oceanic Measurements and Laboratory Applications[M]. 2012.5:99-115
項(xiàng)目名稱:應(yīng)用ATP發(fā)光法的日化產(chǎn)品抗菌抑菌檢測(cè)方法研究
項(xiàng)目編號(hào):KJ2014004
作者簡(jiǎn)介:
邱皓璞 1989.5 男 江蘇南京 助理工程師 學(xué)士學(xué)位,研究方向:食品相關(guān)產(chǎn)品