四種變溫層積對老山芹種子胚發(fā)育及生理特性的影響

李富恒，張雪霞，趙恒田，于 萍，吳旭飛，吳晶晶，劉玉美，張曉雯

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081）

老山芹（Heracleum moellendorffii Hance）是傘形科牛防風屬多年生宿根草本植物，學名東北牛防風，又名山芹菜、短果回芹和大葉芹等[1]。老山芹為耐陰植物，多分布于針闊葉混交林、雜木林下及溝谷濕地等處，是東北林區(qū)主要山野菜品種之一。老山芹富含維生素C、核黃素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，幼嫩莖葉可食，全株可作為優(yōu)質(zhì)飼料。老山芹可入藥，具有醫(yī)療保健價值，幫助胃腸蠕動、清理腸道垃圾，治療風濕性關(guān)節(jié)炎、腰膝酸痛、頭痛、高血壓、高血糖及高血脂等疾病[3]。

作為野生植物，老山芹種子具有休眠特性，生產(chǎn)上存在種子發(fā)芽率低、催芽難度大、出苗不整齊、育苗技術(shù)不成熟、育苗周期過長等問題，限制老山芹生產(chǎn)規(guī)模擴大與發(fā)展。在老山芹需求量不斷增加、野生資源日益枯竭情況下，開展老山芹種子休眠機理及打破休眠技術(shù)研究十分必要，可保護林區(qū)生態(tài)環(huán)境、發(fā)展林下經(jīng)濟、實現(xiàn)老山芹大面積人工栽培。

種子休眠原因復雜，其中胚后熟是一個重要原因。胚后熟又可分為三種類型：形態(tài)后熟型、生理后熟型及復合后熟型。銀杏形態(tài)后熟型種子采收時外部形態(tài)已近成熟[4]，但胚尚未分化完全，仍需從胚乳中吸收養(yǎng)料，繼續(xù)分化發(fā)育，直至完全成熟才能發(fā)芽；櫻桃、山楂、梨、蘋果等果樹種子屬生理后熟型[5]，采收時胚外部形態(tài)雖已具備成熟特征，但生理上必須通過后熟過程，在種子內(nèi)部完成一系列生理生化變化后才能萌發(fā)；許多種子休眠兼具形態(tài)后熟及生理后熟，是一種復合后熟類型，如短梗五加[6]、山茱萸[7]、西洋參[8]、華重樓[9]、東北紅豆杉[10]、北五味子[11]、三七[12]、大葉白蠟[13]等。目前老山芹研究多局限于栽培技術(shù)[14]、植株及種子生長發(fā)育特性[15]、層積條件下種子形態(tài)變化[16]等方面，缺乏胚后熟及種子休眠機理深入研究。因此，有必要開展老山芹種子形態(tài)及生理后熟綜合研究。

本研究以老山芹種子為材料，共設(shè)四種不同變溫層積處理，定期取樣，制作裝片觀察種胚發(fā)育情況并顯微攝影，測定種子形態(tài)及生理生化指標，分析兩類指標動態(tài)變化規(guī)律及其與種子后熟關(guān)系，為揭示老山芹種子休眠機理、打破種子休眠、發(fā)展老山芹產(chǎn)業(yè)、調(diào)整林區(qū)經(jīng)濟結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為五年生老山芹植株收獲種子，2016年8月采于中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所（哈爾濱市）試驗田，自然晾干備用。

1.2 方法

1.2.1 種子層積處理及取樣

清水沖洗細砂并除去雜質(zhì)，置于100℃烘箱高溫滅菌3 h，取出晾至室溫，加入適量蒸餾水攪拌至細砂可握成團但不滴水為止。選籽粒飽滿種子，75%乙醇消毒30 s后再置于蒸餾水中浸種6 h。將處理好種子與細砂按照2∶3混勻后放入盛有濕沙塑料盒（長×寬×高，19 cm×13 cm×11 cm），蓋子打小孔以利空氣交換，按照以下四種方法變溫層積處理：

① 20℃，20 d→4℃，30 d→-20℃，10 d→4℃，30 d→20℃，15 d

② 20℃，15 d→4℃，35 d→-20℃，10 d→4℃，35 d→20℃，10 d

③ 20℃，10 d→4℃，90 d→20℃，5 d

④ 20℃，25 d→4℃，35 d→-20℃，5 d→4℃，35 d→20℃，5 d

層積過程中第0、15、30、45、60、75、90、105天分別取樣，每隔10 d清洗一次種子和細砂。

1.2.2 種胚形態(tài)觀察及指標測定

將不同層積處理每隔15 d取樣洗凈，挑選籽粒飽滿、尺寸相近種子去除種被，游標卡尺測定胚乳長。解剖刀剝離種胚制作臨時裝片，顯微鏡下用直線式測微尺測定胚長及顯微攝影。重復測量10次，取平均值，計算胚率。測量標準如下：

胚乳長：游標卡尺測量胚乳長度最大值；

胚長：直線測微尺測量種胚長度的最大值；

胚率：胚率（%）=胚長/胚乳長×100%。

1.2.3 種子生理生化指標測定

可溶性糖、淀粉含量采用蒽酮法測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G250法測定，粗脂肪含量采用索氏提取法測定[17]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

運用Excel 2003繪圖，DPS7.05統(tǒng)計分析軟件處理與分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同變溫層積處理對老山芹種胚發(fā)育進程影響

老山芹種子采收時大部分種子種胚處于心形胚后期階段（見圖1a），層積過程中，由于后熟作用種胚逐漸生長發(fā)育，但四種變溫層積處理條件下種胚發(fā)育進程差異較大。

層積15 d時除處理三有5 d為4℃低溫外，其他三個處理均為20℃暖溫層積條件，四個處理種胚形態(tài)和體積均未發(fā)生顯著變化，與未處理時基本一致。

層積30 d時觀察種胚有進一步發(fā)育跡象，處理三進入魚雷形胚時期（見圖1b），其他處理種胚依然處于心形胚后期。

層積45 d時，各處理種胚形態(tài)均已發(fā)生明顯變化，處理一和處理二種胚從心形胚后期開始向魚雷形胚時期發(fā)育；此時處理三在4℃低溫下已持續(xù)35 d，種胚發(fā)育進程較快，已達到魚雷形胚后期（見圖1c），子葉伸長較明顯；而處理四種胚發(fā)育較為遲緩，未進入魚雷形胚時期。處理一、處理二、處理三和處理四前期20℃暖溫層積時間分別是20、15、10和25 d，隨后轉(zhuǎn)入4℃低溫層積分別持續(xù)25、30、35和20 d，其中處理一、處理二和處理三均在45 d時使種胚發(fā)育成魚雷形胚，而處理四種胚發(fā)育較慢，說明暖溫層積影響種胚形態(tài)后熟，但時間不宜過長，要及時轉(zhuǎn)入低溫層積階段。

處理一和處理二層積60 d時種胚進入魚雷形胚后期，處理三種胚兩片子葉繼續(xù)伸長生長，而處理四種胚方發(fā)育至魚雷形胚時期。

層積75 d時，處理一和處理二種胚形態(tài)和體積與60 d時相比變化小，與經(jīng)歷10 d-20℃冷凍處理有關(guān)，冷凍抑制種胚代謝活動，需一定時間才可恢復發(fā)育進程；此時可觀察到處理三種胚進入子葉期胚階段（見圖1d），兩片子葉開始變寬變長，但子葉脈序較模糊；處理四種胚發(fā)育至魚雷形胚后期，較處理一和處理二晚15 d，原因可能與該處理前期20℃暖溫層積時間過長（25 d）有關(guān)。

層積90 d時，處理一、處理二和處理四種胚子葉吸收胚乳營養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)生長，處理三種胚子葉繼續(xù)變大，子葉脈序已清晰可見（見圖1e）。

處理一、處理二和處理四層積105 d時，種胚兩片子葉分化，進入子葉期胚階段，但子葉上脈序較模糊，比處理三晚近30 d；此時處理三種胚子葉較大、脈序較清晰（見圖1f）。

層積結(jié)束時四種變溫層積處理4℃低溫下分別處理60、70、90和70 d，表明4℃低溫層積階段持續(xù)時間對種胚發(fā)育進程形態(tài)影響較大，時間越長越有利于種胚發(fā)育。比較四種變溫層積處理，層積方法處理三模式更利于老山芹種胚形態(tài)后熟完成，是一種經(jīng)濟有效的種子處理方法。

2.2 不同變溫層積處理條件下老山芹種胚生長動態(tài)

2.2.1 胚長

隨層積時間延長，各處理種胚長度均不斷增長，但每個處理胚長動態(tài)變化過程因溫度和時間控制不同，表現(xiàn)出較大差異（見圖2）。四種變溫層積過程中種胚長度與層積時間關(guān)系分別用回歸方程 y=0.0034x+0.5408、 y=0.0036x+0.5453、 y=0.0053x+0.5133和y=0.0034x+0.54表示。

層積15 d時，各處理胚長從層積前0.51 mm增長至0.58～0.61 mm，增長13.7%～19.6%，各處理種胚長度相差小，未達顯著水平，其中處理三胚長較其他處理略低（0.58 mm），可能與處理三為10 d 20℃暖溫層積加5 d 4℃低溫層積，而其他處理均為15 d 20℃暖溫層積有關(guān)。

圖1 變溫層積過程中老山芹種胚發(fā)育進程Fig.1 Development of embryo in Heracleum moellendorffii Hance seeds during the process of variable temperature stratification

圖2 不同變溫層積條件下胚長動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of embryo length under different variable temperature stratification conditions

層積30 d時，各處理胚長分別為0.65、0.68、0.69和0.65 mm，差異不顯著；與層積15 d相比，各處理種胚長度分別增長0.05、0.08、0.11和0.04 mm，增長8.3%、13.3%、19.0%和6.6%，處理三種胚增長速率變快。

層積45 d時，各處理種胚長度比層積30 d時分別增加0.04、0.05、0.08和0.06 mm，處理三種胚仍保持較快生長速度，其種胚長度顯著高于其他處理（P＜0.05），而其他處理間種胚長度無顯著差異。層積50 d后將處理一和處理二分別轉(zhuǎn)入-20℃條件放置10 d，而處理三和處理四保持4℃低溫層積條件。

層積60 d時，各處理種胚長度較層積45 d時分別增長0.02、0.02、0.04和0.03 mm，達0.71、0.75、0.81和0.73 mm。處理三種胚長度極顯著高于處理一（P＜0.01），顯著高于處理四，而與處理二無顯著差異。-20℃冷凍10 d處理一和處理二種胚增長速率變慢。

層積75 d時，各處理種胚長度分別為0.79、0.81、0.89和0.79 mm，與層積60 d相比分別增長0.08、0.06、0.08和0.06 mm，分別增長11.3%、8.0%、9.9%和8.2%，此時處理一和處理二離開-20℃冷凍條件，恢復代謝種胚增長速度加快，從層積第10天起一直處于4℃低溫，處理三種胚長度極顯著高于處理一和處理四，顯著高于處理二。

層積90 d時各處理種胚長度比層積75 d時分別增 加 0.07、0.07、0.05 和 0.04 mm，達 0.86、0.88、0.94和0.83 mm，分別增長8.9%、8.6%、5.6%和5.1%，處理一和處理二種胚增長速率較快，處理三種胚長度極顯著高于處理四，顯著高于處理一和處理二；而處理一、處理二和處理四之間均差異不顯著。

圖3 不同變溫層積條件下胚率動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of embryo rate under different variable temperature stratification conditions

層積105 d時，各處理種胚長度較90 d時增長0.03、0.02、0.08和0.09 mm，分別增長3.5%、2.3%、8.5%和10.8%；處理一和處理二種胚增長速率變慢，可能與兩個處理分別提前10 d和5 d轉(zhuǎn)入20℃暖溫層積條件有關(guān)。

經(jīng)105 d變溫層積處理，各處理種胚長度由層積前0.51 mm分別增加0.38、0.40、0.61和0.41 mm，達0.89、0.91、1.12和0.92 mm，分別增長74.5%、78.4%、119.6%和80.4%。四種處理相比較，處理三層積模式極顯著優(yōu)于其他處理，種胚生長最快。

2.2.2 胚率

由圖3可知，層積15 d后種子胚率開始逐漸增大，各處理胚率分別增加2.9%、2.7%、1.5%和2.0%，胚率值分別達15.4%、14.7%、14.2%和15.0%；四種處理相比較，處理三20℃暖溫條件時間最短，胚率值最低，但此時各處理間胚率差異未達顯著水平。

隨種胚不斷伸長，胚率亦逐漸增大，層積至30 d時，胚率分別增加0.7%、1.6%、2.7%和0.3%后達16.1%、16.3%、16.9%和15.3%，此時各處理胚率差異仍未達顯著水平。與層積15 d相比，處理三胚率增長最快，其他處理胚率增長速率均下降，可能與三個處理20℃暖溫層積條件下時間過長有關(guān)。

層積45 d時，與層積30 d相比處理三胚率增長最快，處理二次之，而處理一和處理四胚率增長較慢，各處理胚率分別增加0.8%、1.6%、2.0%和0.8%，胚率值分別達16.9%、17.9%、18.9%和16.1%。處理三胚率值極顯著高于處理四，而與處理一和處理二差異不顯著。

層積60 d時，與層積45 d相比各處理種子胚率分別增長0.5%、0.5%、1.0%和0.8%后達17.4%、18.4%、19.9%和16.6%。處理三胚率增長速率變慢，其胚率值極顯著高于處理一和處理四，而與處理二無顯著差異；此期間處理一和處理二經(jīng)-20℃冷凍10 d層積條件，代謝活動受阻，胚率增長速率減慢，增長率僅為處理三一半。

層積75 d時，各處理種子胚率分別增長2.0%、2.0%、2.0%和1.9%，胚率值分別為19.4%、20.3%、21.9%和18.8%，處理三胚率值極顯著高于處理一和處理四，顯著高于處理二。處理一和處理二此階段胚率增長加快，與兩個處理冷凍后再次轉(zhuǎn)入4℃低溫條件、使種子恢復正常代謝活動有關(guān)。此階段各處理胚率均開始加快增長，說明此階段是種胚發(fā)育重要時間節(jié)點，層積過程中要加強管理，促進種胚生長。

層積90 d時，各處理胚率依然保持較高增長速率，分別較前階段增加1.7%、1.2%、1.1%和1.6%，胚率值分別達21.1%、21.6%、23.0%和20.3%。其中處理三胚率值極顯著高于處理四，顯著高于處理一，而與處理二差異未達顯著水平。

層積105 d時，胚率分別較前期增加0.7%、0.7%、4.4%和2.2%，其中處理三胚率值增加最多，比處理一和處理二高近六倍，比處理四高近兩倍；處理一和處理二胚率值增加明顯減慢，可能與兩個處理分別提前15 d和10 d轉(zhuǎn)入20℃暖溫層積條件有關(guān)。此時各處理胚率值分別為21.8%、22.3%、27.5%和22.5%，處理三胚率值極顯著高于其他處理，而處理一、處理二和處理四之間均差異不顯著。

四種不同變溫層積處理后種子胚率均有不同程度增加，四種變溫層積過程中胚率與層積時間關(guān)系分別以回歸方程y=0.0827x+13.215、y=0.0909x+13.242、y=0.1294x+12.582和 y=0.0835x+12.854表示。經(jīng)105 d變溫層積處理，各處理胚率值由層積前12.6%分別增加9.1%、9.6%、14.8%和9.9%，達21.8%、22.3%、27.5%和22.5%。四種處理相比較，處理三胚率增加最多，極顯著高于其他處理，層積效果最好。

2.3 變溫層積過程中老山芹種子生理生化指標動態(tài)變化

2.3.1 可溶性糖

由表1可知，與未層積時相比，各處理層積15 d后可溶性糖含量均呈下降趨勢，但下降幅度小，各處理間差異不顯著。層積30 d時，各處理可溶性糖含量差異提高，呈顯著差異，其中處理二極顯著高于其他處理；處理一極顯著高于處理三和處理四；處理三顯著高于處理四。層積過程中胚乳貯藏物質(zhì)由于代謝活動而分解，與層積15 d時相比較，處理一和處理二可溶性糖含量分別增加3.65和20.11 mg· g-1，升至167.78和185.63 mg· g-1，兩個處理胚發(fā)育較慢，物質(zhì)消耗量少，可溶性糖含量小幅升高。而處理三和處理四則分別減少34.51和45.77 mg· g-1，降至119.64和106.39 mg·g-1，此時正是處理三種胚迅速分化發(fā)育時期，可溶性糖被大量消耗；而處理四可溶性糖含量下降是20℃暖溫層積條件時間過長，種子呼吸消耗物質(zhì)過多所致。

表1 四種變溫層積處理過程中可溶性糖含量變化Table 1 Changes of soluble sugar content in four variable temperature stratification processes (mg·g-1)

層積45 d時，四種處理可溶性糖含量分別是211.52、158.49、128.09和121.46 mg· g-1，其中處理一極顯著高于其他處理；處理二極顯著高于處理三和處理四；而處理三和處理四之間差異不顯著。處理一可溶性糖含量較層積30 d時增加43.74 mg·g-1，達到層積期間峰值211.52 mg·g-1；處理二可溶性糖含量減少27.14 mg·g-1；處理三和處理四可溶性糖含量略有上升，分別增加8.45和15.07 mg·g-1。

層積60 d時，各處理可溶性糖含量分別為193.91、105.50、92.11、132.88 mg· g-1，其中處理一極顯著高于其他處理；處理四極顯著高于處理二和處理三；處理二顯著高于處理三；處理一、處理二和處理三此時均呈下降趨勢，而處理四則呈上升趨勢。處理一和處理二可溶性糖含量下降可能與種子轉(zhuǎn)至-20℃冷凍條件使代謝活動減弱有關(guān)；而處理三此時種胚發(fā)育較快、消耗營養(yǎng)物質(zhì)過多，故可溶性糖含量低。

層積75 d時，除處理四在-20℃冷凍5 d后又轉(zhuǎn)至4℃低溫繼續(xù)層積外，其他處理均是4℃低溫條件下層積。與層積60 d相比較，處理一、處理二和處理四可溶性糖含量分別下降9.49、12.86和27.05 mg·g-1，而處理三上升10.06 mg·g-1。四個處理相比，其中處理一極顯著高于其他處理，其他處理差異小。

層積90 d時，各處理可溶性糖含量分別為173.41、84.82、134.60和91.39 mg· g-1，其中處理三比層積75 d時增加32.43 mg·g-1，其他處理均呈下降趨勢，分別減少11.01、7.82和14.44 mg·g-1，可能與此時種胚生長加速，消耗營養(yǎng)物質(zhì)過多有關(guān)。

105 d層積結(jié)束時，各處理可溶性糖含量分別為158.99、139.93、122.88和76.11mg· g-1，各處理間均表現(xiàn)極顯著差異。處理一、處理三和處理四可溶性糖含量分別減少14.42、11.72和15.28 mg·g-1，而處理二可溶性糖含量增加55.11 mg·g-1。此時處理一和處理四種胚生長加速，消耗營養(yǎng)物質(zhì)較多，處理三種胚已發(fā)育完全。

四種變溫層積處理過程中老山芹種子可溶性糖含量總體上呈先降后升再降趨勢，但較未處理種子相比均有不同程度下降。各處理出現(xiàn)第一個峰值時間分別為層積后第45、30、45和60天；處理二和處理三第二個峰值則出現(xiàn)在105 d和90 d，而處理一和處理四無第二峰值。除處理三外，其他處理均有一定時間-20℃冷凍條件，且處理三在20℃暖溫層積條件下經(jīng)歷時間較短，說明20℃暖溫層積條件和-20℃冷凍條件均對可溶性糖含量產(chǎn)生影響，影響種胚發(fā)育。

2.3.2 淀粉

由表2可知，與未層積時相比，層積15 d時四種處理淀粉含量略有下降，分別減少9.5%、9.3%、11.0%和9.8%，此時各處理間淀粉含量差異均不顯著；其中處理三下降較多，這可能與處理三前15 d中有5 d處于4°C低溫使種胚發(fā)育較其他處理略快有關(guān)。

層積30 d時，淀粉含量依然呈下降趨勢，各處理較層積15 d時分別降低9.6%、11.6%、18.5%和6.4%。處理三淀粉含量最低，與其他各處理呈極顯著或顯著差異。

隨4℃低溫處理時間延長，淀粉分解速率加快，層積45 d時，各處理淀粉含量較層積30 d時分別下降20.0%、15.2%、21.1%和12.3%。處理四顯著高于處理二、極顯著高于處理一和處理三，處理一和處理二之間差異不顯著，但兩個處理極顯著高于處理三。

層積60 d時，各處理淀粉含量較層積45 d時分別下降3.6%、4.0%、7.0%和5.6%。處理四淀粉含量極顯著高于處理一和處理三，顯著高于處理二；處理二和處理三之間差異極顯著；處理一和處理三之間差異顯著。

層積75 d時，各處理淀粉含量仍呈下降趨勢，較層積60 d時分別下降19.1%、21.3%、12.5%和10.26%。處理四淀粉含量極顯著高于其他處理，而其他處理間均表現(xiàn)為差異不顯著。此時處理一和處理二淀粉含量下降較快，可能與其從-20℃冷凍階段轉(zhuǎn)入4℃低溫階段，種子代謝活動恢復有關(guān)。處理四淀粉含量下降較慢，與此時處理四經(jīng)歷5 d-20℃冷凍階段有關(guān)。

層積90 d時，各處理淀粉含量較層積75 d時分別下降7.7%、10.5%、33.6%和14.8%。處理三極顯著低于其他處理；處理四顯著高于處理一和處理二；處理一和處理二差異不顯著。此時各處理淀粉含量分別減少0.74、1.01、2.98和1.75 mg·g-1，其中處理三下降最快，與此時處理三可溶性糖含量對應。

105 d處理結(jié)束時，處理三極顯著低于處理一和處理四、顯著低于處理二；其他處理間均表現(xiàn)為差異不顯著。各處理淀粉含量較層積90 d時分別下降15.6%、18.3%、2.5%和21.6%，其中處理四下降最多、處理三下降最少。說明種胚發(fā)育快的處理此時淀粉含量下降少，發(fā)育慢淀粉含量下降多，即種胚發(fā)育需分解淀粉為可溶性糖作為能量和原料來源。

四種變溫層積處理均使老山芹種子淀粉含量呈下降趨勢，四種變溫層積過程中種子淀粉含量與層積時間關(guān)系分別以回歸方程y=-0.11x+18.197、y=-0.1119x+18.47、y=-0.1279x+18.083和y=-0.0982x+18.705表示。各處理不同時期淀粉含量減少程度相比，處理三在層積90 d下降最快，此時處理三種胚發(fā)育較快，子葉上脈序已清晰可見，消耗淀粉量較大。

2.3.3 可溶性蛋白質(zhì)

由表3可知，與未層積時相比，各處理層積15 d后可溶性蛋白質(zhì)含量上升，分別較未層積時增加209.96、251.54、179.53和257.83 mg· g-1，其中處理三可溶性蛋白質(zhì)含量漲幅略小于其他處理，顯著低于處理二和處理四。此時層積前期20℃暖溫階段種子代謝活躍，多種蛋白質(zhì)及酶大量合成，可溶性蛋白質(zhì)含量上升。

層積30 d時，各處理可溶性蛋白質(zhì)含量較層積15 d時均出現(xiàn)大幅下降，分別下降18.8%、31.4%、44.0%和30.0%。處理一極顯著高于其他處理，處理二和處理四極顯著高于處理三，而處理二和處理四差異不顯著。其中處理三下降幅度最大，是處理一兩倍，與此階段處理三種胚生長加速、營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多有關(guān)。

表2 四種變溫層積處理過程中淀粉含量變化Table 2 Changes of starch content in four variable temperature stratification processes (mg·g-1)

層積45 d時，各處理可溶性蛋白質(zhì)含量比層積30 d時分別下降4.1%、2.5%、4.0%和7.6%。此時處理一可溶性蛋白質(zhì)含量極顯著高于其他處理，處理二和處理四極顯著高于處理三，而處理二和處理四差異不顯著。此階段較層積30 d時下降幅度明顯趨緩。

層積60 d時，各處理間可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)不一，有升有降，各處理間均表現(xiàn)為極顯著差異。此時處理三和處理四可溶性蛋白質(zhì)含量繼續(xù)下降，分別減少107.80和12.68 mg·g-1，處理三可溶性蛋白質(zhì)含量大幅下降可能與種胚此時生長加速、消耗蛋白質(zhì)過多有關(guān)。而處理一和處理二可溶性蛋白質(zhì)含量上升，分別增加123.52和79.94 mg·g-1，可能與兩個處理轉(zhuǎn)至-20℃冷凍階段使代謝活動減少有關(guān)。

層積75 d時，各處理可溶性蛋白質(zhì)含量分別為538.35、371.63、378.67和601.24 mg· g-1，處理四極顯著高于其他處理，處理一極顯著高于處理二和處理三，而處理二和處理三間差異不顯著。處理一和處理二經(jīng)15 d 4℃低溫階段后可溶性蛋白質(zhì)含量分別減少281.86和316.68 mg·g-1，可能與兩個處理從-20℃冷凍階段轉(zhuǎn)至4℃低溫階段使種子恢復代謝、種胚生長加速有關(guān)。

層積90 d時，各處理可溶性蛋白質(zhì)含量分別為667.57、438.88、458.70和246.08 mg· g-1。與層積75 d相比，處理一、處理二和處理三均呈上升趨勢，分別升高24.0%、18.0%和21.1%；處理四則呈下降趨勢，下降59%。此時處理一極顯著高于其他處理；處理二和處理三極顯著高于處理四；處理二和處理三之間差異不顯著。此期間處理四種胚生長較快，消耗蛋白質(zhì)過多。

層積105 d時，處理一、處理二和處理三可溶性蛋白質(zhì)含量較層積90 d時分別下降30.1%、9.7%和19.1%，其中處理一下降幅度最大；而處理四可溶性蛋白質(zhì)含量則上升25.5%。此時處理一極顯著高于其他處理；處理二和處理三極顯著高于處理四；處理二和處理三之間差異不顯著。

整個層積過程中，各處理可溶性蛋白質(zhì)含量變化較大，呈先升再降趨勢，由未層積時658.67 mg·g-1分別降至層積結(jié)束時465.99、395.91、370.78和308.92 mg·g-1。其中處理三有90 d處于4℃低溫階段，其可溶性蛋白質(zhì)含量在多數(shù)取樣期較其他處理低，且種胚生長較快，說明種胚生長需消耗較多蛋白質(zhì)。而處理一和處理二45～60 d時經(jīng)歷一定時間-20℃冷凍階段，此期間可溶性蛋白質(zhì)含量大幅上升，與-20℃冷凍階段蛋白質(zhì)消耗減少、抗寒性蛋白質(zhì)大量合成有關(guān)。各處理可溶性蛋白質(zhì)含量大幅下降時間分別為層積后75、75、60和90 d，處理三大幅下降時間最早、種胚發(fā)育最快，處理四大幅下降時間最早最遲，種胚發(fā)育最慢。說明可溶性蛋白質(zhì)含量變化與種胚發(fā)育進程有關(guān)。

2.3.4 粗脂肪

由表4可知，與未層積時相比較，層積15 d后各處理粗脂肪含量變化較小，分別減少0.17%、0.20%、0.35%和0.25%，各處理間粗脂肪含量均無顯著差異。

層積30 d時，各處理粗脂肪含量較層積15 d時分別減少0.51%、0.68%、0.86%和0.29%。處理一和處理四顯著高于處理三，而處理二和處理三之間差異不顯著。此時粗脂肪含量下降速度加快，其中處理三下降幅度最大，其次為處理二和處理一，處理四下降幅度最小。

層積45 d時，種子粗脂肪含量呈下降趨勢，各處理較層積30 d時分別減少0.55%、0.41%、0.73%和0.42%。處理一、處理二和處理四之間差異不顯著；處理一和處理四極顯著高于處理三；處理二顯著高于處理三。

層積60 d時，各處理較層積45 d時粗脂肪含量分別減少0.12%、0.14%、0.61%和0.45%。此時處理三粗脂肪含量極顯著低于其他處理，其他處理間均表現(xiàn)為差異不顯著。處理一和處理二粗脂肪含量下降速率顯著低于處理三，原因是兩個處理有10 d處于-20℃冷凍條件，種子代謝活動減慢；而處理三和處理四粗脂肪含量下降速率較層積45 d時無明顯變化。

層積75 d時，仍表現(xiàn)為處理三粗脂肪含量極顯著低于其他處理，其他處理間均表現(xiàn)為差異不顯著。各處理粗脂肪含量降低幅度較大，分別降低0.87%、0.87%、0.60%和0.45%。其中處理一和處理二粗脂肪含量下降速率加快，此時已從-20℃冷凍條件轉(zhuǎn)換至4℃低溫條件；處理三下降速率保持不變；而處理四下降速率較慢，經(jīng)歷5 d-20°C冷凍條件。

表4 四種變溫層積處理過程中粗脂肪含量變化Table 4 Changes of crude fat content in four variable temperature stratification processes (%)

層積90 d時，各處理粗脂肪含量分別減少0.52%、0.79%、0.60%和0.33%。處理三極顯著低于其他處理，處理四極顯著高于處理二和處理三，而與處理一差異不顯著。

105 d層積結(jié)束時各處理粗脂肪含量分別較層積90 d時減少0.69%、0.96%、0.83%和1.14%。處理三極顯著低于其他處理；處理一和處理四差異不顯著；處理一與處理二差異顯著。

經(jīng)變溫層積處理后，各處理粗脂肪含量從未層積時8.27%分別下降3.43%、4.05%、4.58%和3.62%，降至4.84%、4.22%、3.69%和4.65%，粗脂肪含量總體呈下降趨勢。四種變溫層積過程中粗脂肪含量與層積時間關(guān)系分別以回歸方程：y=-0.0328x+8.5126、y=-0.0379x+8.6176、y=-0.0441x+8.4037、y=-0.0326x+8.5489表示。四種處理相比較，處理三粗脂肪含量下降最多，處理二和處理四次之，處理一下降最少。

3 討論與結(jié)論

3.1 老山芹種子休眠類型

種子休眠是指有生命種子在適宜環(huán)境條件下仍不萌發(fā)現(xiàn)象[18]，是種子為度過外界不良環(huán)境而形成的一種適應性生物學特性，對植物個體生存和進化具有重要意義。自然條件下播種老山芹種子，需越冬后第二年春天萌發(fā)，部分種子則可能需更長時間，出芽率低、出苗不齊和育苗周期長等問題限制老山芹產(chǎn)業(yè)發(fā)展。研究老山芹種子休眠機理具有重要意義。

種子休眠類型多且復雜，Baskin等將種子休眠分為物理休眠、形態(tài)休眠、生理休眠、形態(tài)生理休眠和復合休眠五種類型[19]。種子具有堅硬厚實外殼使透氣透水性變差，引起休眠為物理休眠[20]。劉增兵對老山芹種子作吸水試驗，結(jié)果表明老山芹種被對種子吸水影響較小，不會構(gòu)成種子萌發(fā)障礙[21]。說明老山芹種子不存在物理休眠，是種子內(nèi)部因素引起休眠。種子脫離母體后胚未分化或胚已分化但未發(fā)育完全引起休眠稱為形態(tài)休眠。本研究結(jié)果表明，老山芹種子采收時種胚較小，胚率僅為12.6%，種胚發(fā)育程度不一致，但大多數(shù)種胚處于心形胚后期階段，層積過程中不斷分化發(fā)育，胚率逐漸增大，最后發(fā)育至作為成熟胚標志子葉期胚階段，具備發(fā)芽能力，說明老山芹種子存在形態(tài)休眠。

生理休眠是指種子脫離母體后雖然種胚已發(fā)育完全，但還不具備萌發(fā)能力，需經(jīng)一段時間完成生理后熟積累種子萌發(fā)所需營養(yǎng)物質(zhì)后才有萌發(fā)可能。形態(tài)生理休眠是指植物種子同時具備形態(tài)休眠和生理休眠生物學特性[22]；復合休眠是指植物種子同時具備物理和生理休眠生物學特性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，層積處理結(jié)束后雖然老山芹種胚已發(fā)育到子葉期胚階段，種胚已發(fā)育完全，但催芽過程中種子萌發(fā)率仍較低。劉增兵研究表明老山芹種子內(nèi)存在大量抑制物質(zhì)[21]。因此，可初步認為老山芹種子是形態(tài)生理休眠類型。但其生理休眠具體機制尚不清楚，有待深入研究。

3.2 形態(tài)生理休眠類型種子打破休眠措施

張恩和等采用變溫（15～25℃/2～5℃）層積處理野生羌活種子，暖溫層積促進種胚分化發(fā)育完成形態(tài)后熟，低溫層積促進種子生理后熟完成[24]；何利平對刺楸氣干種子的研究表明，5～15℃沙藏110 d種子完成形態(tài)后熟后，需繼續(xù)沙藏，種子完成生理后熟萌發(fā)[25]；黃瑋等研究結(jié)果表明，經(jīng)180 d變溫層積處理，滇重樓種子雖已完成胚形態(tài)后熟，但種子仍不萌發(fā)，需再繼續(xù)低溫處理，待種子完成生理后熟才具備發(fā)芽能力[26]；葛超等對短梗五加種子研究表明，種子萌發(fā)不受種皮阻礙影響，需先暖溫層積條件下使種胚分化生長，再轉(zhuǎn)入低溫層積處理完成生理后熟促進種子萌發(fā)[6]。本研究設(shè)計四種變溫層積處理探討打破老山芹種子休眠方法，變溫層積過程中4℃低溫持續(xù)時間對種胚發(fā)育進程影響最大，時間越長越有利于種胚發(fā)育；四種變溫層積處理相比較，處理三模式（20℃，10 d→4℃，90 d→20℃，5 d）更利于老山芹種胚形態(tài)后熟完成，最早進入子葉期胚，胚長和胚率增長最快，是一種經(jīng)濟有效的種子處理方法。未來需深入研究，高效打破種子休眠。

3.3 老山芹種子胚形態(tài)后熟過程與營養(yǎng)物質(zhì)變化關(guān)系

種子后熟是代謝過程，需提供原料和能量，伴隨復雜的代謝活動[27]?？扇苄蕴菫榉N子代謝活動提供能量基礎(chǔ)物質(zhì)，用于消耗；淀粉、蛋白質(zhì)和粗脂肪是種子中主要貯藏物質(zhì)，種子后熟和萌發(fā)過程中會被分解為小分子物質(zhì)，為種胚發(fā)育提供原料和能量。具有形態(tài)生理休眠類型的北五味子[11]、南方紅豆杉[28]和秤錘樹[29]等種子，層積處理過程中種胚分化發(fā)育與伸長生長同時伴隨營養(yǎng)物質(zhì)分解、轉(zhuǎn)化及利用。

種子層積期間淀粉及粗脂肪被分解，繼而轉(zhuǎn)化成可溶性糖及其他小分子物質(zhì)為種胚生長發(fā)育利用，可溶性蛋白質(zhì)會降解成氨基酸，形成不含氮化合物和游離氨，其中不含氮化合物會轉(zhuǎn)化成糖類為種子呼吸代謝提供能量，游離氨會在可溶性糖積累達到一定閾值時，重新形成氨基酸，合成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與種胚形態(tài)分化發(fā)育的結(jié)構(gòu)蛋白及某些酶類有關(guān)[29]。本研究結(jié)果表明，層積處理前期，老山芹種子可溶性糖、淀粉及粗脂肪含量下降，可溶性蛋白質(zhì)含量上升，與東北紅豆杉[10]、北五味子[11]和三七[12]在層積前期種子生理生化變化研究結(jié)果一致。隨層積時間延長，淀粉和脂肪被不斷分解，可溶性蛋白質(zhì)分解速率加快、含量下降，其中處理一、處理二和處理四種胚生長較慢，可溶性糖消耗較少，含量增加出現(xiàn)峰值，之后種胚生長速率加快，可溶性糖出現(xiàn)下降趨勢。處理三種子種胚生長速率較其他處理快，整個層積過程種子可溶性糖消耗速率較高，因此可溶性糖一直呈下降趨勢。當處理一、處理二和處理四進入-20℃冷凍階段時，種子呼吸代謝活動變慢，種胚生長速率減小，因此淀粉和粗脂肪含量下降緩慢，可溶性蛋白質(zhì)含量略有上升。冷凍解除后，代謝活動和種胚生長逐漸恢復正常，但由于水解酶被-20℃鈍化，需逐步提高活性，可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白和粗脂肪含量均呈下降趨勢。層積后期處理三種胚發(fā)育至子葉期胚階段，形態(tài)后熟已基本完成，物質(zhì)消耗減少，可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量升高。

本研究表明，處理三（20℃，10d→4℃，90d→20℃，5 d）較其他處理種胚分化發(fā)育速度快，且可溶性蛋白質(zhì)、淀粉及粗脂肪轉(zhuǎn)化和利用均早于其他處理。說明-20℃冷凍階段并非必需，采用暖溫-低溫-暖溫變溫層積方法有利于老山芹種子后熟，但暖溫層積時間不宜過長。

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