不同香型大曲酯化酶的特性分析

邢爽，魏志陽，郭學(xué)武，王亞平，諶柄旭，李秋志,2，肖冬光

（1.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）（2.河北山莊老酒股份有限公司，河北承德 067500）

酯類物質(zhì)是白酒中所占比例最大的香味物質(zhì)，其中主要包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯，稱為四大酯類[1]。清香型白酒以乙酸乙酯和乳酸乙酯為主體香；濃香型白酒以己酸乙酯為主體香，與乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等一起構(gòu)成復(fù)合香氣；醬香型白酒香味成分最為復(fù)雜，酯類物質(zhì)分布較廣[2～4]。這些酯類物質(zhì)形成與白酒發(fā)酵過程中所用的大曲有很大關(guān)系，白酒風(fēng)格的形成與所用大曲也息息相關(guān)。

大曲是糖化發(fā)酵劑，“曲是酒之骨，好曲出好酒”，因此大曲在白酒釀造過程中起著非常重要的作用[5～7]。大曲一般采用小麥、大麥和豌豆等原料，經(jīng)粉碎拌水后壓制成磚塊狀的曲坯，人工控制一定的溫度和濕度，讓自然界中的各種微生物在上面生長而制成[8,9]。清香型大曲以大麥和豌豆為原料，制曲溫度不超過50 ℃，是中溫曲的典型代表。醬香型大曲采用純小麥為原料，制曲溫度高，品溫最高可達(dá)65～68 ℃。濃香型大曲制曲原料各酒廠情況不一，主要以小麥為主，最高品溫介于醬香型酒曲和清香型酒曲之間，大多控制在55 ℃左右[10～12]。大曲中含有豐富的釀酒微生物菌系和酶系，其中酶系包括糖化酶、淀粉酶、蛋白酶和酯化酶等，大曲酯化酶可催化酸和醇生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)[13]。不同香型大曲由于制曲原料、制曲環(huán)境和制曲工藝的差異，所網(wǎng)羅的微生物菌系不同，導(dǎo)致酯化酶的催化特性也有所不同。

本文主要研究白酒三大香型大曲-清香型大曲、濃香型大曲和醬香型大曲酯化酶的活力與催化特性，探討不同酸濃度和pH值下不同香型大曲催化合成乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯的規(guī)律，為白酒生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型大曲，清香型大曲，醬香型大曲：某大曲生產(chǎn)廠提供；乙酸、乳酸、己酸、丁酸、乙醇：分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、硫酸：分析純，天津市津科精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SeverEasy型pH計(jì)：瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀：美國安捷倫科技公司；DHP恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸濃度對三種香型大曲酯化酶活力的影響

采用250 mL螺口試劑瓶，以體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇溶液作為溶劑，加大曲粉5 g，按表1配制不同乙酸、乳酸、丁酸和己酸濃度的反應(yīng)液，pH自然，反應(yīng)液總體積100 mL。以不加曲粉的反應(yīng)體系為對照組，且將對照組的pH與實(shí)驗(yàn)組pH調(diào)成一致。30 ℃靜置反應(yīng)7 d后，測定相應(yīng)的酯含量。

表1 不同酸濃度反應(yīng)液的配制Table 1 The preparation of reaction fluid with different acid concentration

1.3.2 pH對三種香型大曲酯化酶活力的影響

反應(yīng)體系及條件同 1.3.1，在保持各酸濃度不變（根據(jù)白酒生產(chǎn)時的實(shí)際情況，乙酸和乳酸濃度取25 g/L、己酸和丁酸濃度取8 g/L）情況下，用NaOH和H2SO4溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH分別為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0。

1.4 酯化酶活力的測定

1.4.1 酯含量的測定

將反應(yīng)完畢的試樣倒入500 mL蒸餾瓶中，用100 mL蒸餾水洗滌試劑瓶且一并倒入蒸餾瓶中，進(jìn)行蒸餾，接取100 mL蒸餾液，用注射器取1～2 mL蒸餾液過膜添加到氣相色譜瓶中，采用氣相色譜外標(biāo)法檢測，色譜儀為 Agilent7890B，色譜柱采用 Agilent HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），載氣為高純氮?dú)猓ǎ?9.999%）；柱流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測器溫度150 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進(jìn)樣體積為1 μL；分流進(jìn)樣，分流比為10:1[14]。

1.4.2 酯化酶活力計(jì)算

對照組中酯的形成由酸醇的化學(xué)反應(yīng)而來；實(shí)驗(yàn)組添加了大曲粉，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%，曲中的微生物被抑制，不發(fā)揮作用[15]，因此實(shí)驗(yàn)組中酯的形成是酯化酶催化和化學(xué)合成兩方面作用的結(jié)果；酯化酶催化產(chǎn)酯量即為實(shí)驗(yàn)組酯含量與對照組酯含量的差值。酯化酶活力為一定條件下每g曲7天內(nèi)催化合成相應(yīng)酯的量（mg），以mg/g表示，計(jì)算公式如下：

式中，A：酯化酶活力，mg/g；c1：實(shí)驗(yàn)組酯含量，mg/L；c2：對照組酯含量，mg/L；V：反應(yīng)液體積，0.1 L；w：曲粉質(zhì)量，5 g。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個實(shí)驗(yàn)指標(biāo)做三個平行試驗(yàn)，將測定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行運(yùn)算處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用Origin 8.5軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸濃度對三種香型大曲酯化酶活力的影響

在本研究體系中乙醇是過量的，在此前提下研究酸濃度對大曲酯化酶催化的影響。按照1.3.1的方法，在不同酸濃度下進(jìn)行了大曲酯化酶的催化反應(yīng)，結(jié)果如圖1至圖4。

2.1.1 乙酸濃度對大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影響

圖1 乙酸濃度對大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影響Fig.1 Effect of acetic acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl acetate

乙酸濃度對三種香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力的影響見圖 1。從結(jié)果看，三種香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力：清香型大曲＞濃香型大曲＞醬香型大曲；隨著乙酸濃度的升高，三種香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力均是先升高后降低的趨勢，其中清香型和濃香型大曲催化合成乙酸乙酯的最適乙酸濃度為25 g/L，而醬香型大曲為15 g/L。在最適酸濃度下，清香型、濃香型、醬香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力分別為43.95 mg/g、20.72 mg/g、6.02 mg/g。

2.1.2 乳酸濃度對大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影響

圖2為三種香型大曲催化合成乳酸乙酯酶活力隨乳酸濃度變化的趨勢。從結(jié)果看，隨著乳酸濃度的升高，三種香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力均呈下降趨勢；乳酸濃度為5 g/L時其酯化酶活力最高，清香型、濃香型和醬香型大曲的酯化酶活力分別為1.75 mg/g、1.87 mg/g、0.98 mg/g；乳酸濃度為30 g/L時，三種香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力均為負(fù)值，此時大曲酯化酶表現(xiàn)為分解作用。

圖2 乳酸濃度對大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影響Fig.2 Effect of lactic acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl lactate

2.1.3 己酸濃度對大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影響

圖3 己酸濃度對大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影響Fig.3 Effect of caproic acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl caproate

圖3為三種香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力隨己酸濃度變化的曲線。從結(jié)果看，三種香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力：濃香型大曲較強(qiáng)，清香型大曲與醬香型大曲活力相當(dāng)。隨著己酸濃度的增加，三種香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力先升高后降低，其中清香型大曲催化合成己酸乙酯的最適己酸濃度為5 g/L，而濃香型和醬香型大曲為8 g/L。在最適己酸濃度下，清香型、濃香型、醬香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力分別為4.39 mg/g、5.29 mg/g、4.53 mg/g。

2.1.4 丁酸濃度對大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影響

丁酸濃度對三種香型大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影響如圖4所示。從結(jié)果看，隨著丁酸濃度的升高，三種香型大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力變化趨勢有所不同，清香型和濃香型大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力先升高后降低，而醬香型大曲的酶活力逐漸升高；其中清香型大曲催化合成丁酸乙酯最適丁酸濃度為10 g/L，濃香型大曲為15 g/L，而醬香型大曲在丁酸濃度為20 g/L時催化合成丁酸乙酯酶活力最高。

圖4 丁酸濃度對大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影響Fig.4 Effect of butyric acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl butyrate

2.2 pH對大曲酯化酶活力的影響

pH對酶的活性以及穩(wěn)定性影響很大，pH過高或過低，會影響酶蛋白的穩(wěn)定性，使酶遭受不可逆破壞，導(dǎo)致酶蛋白失活而變性，其次影響酶活性中心上必須基團(tuán)的解離狀態(tài)，使其與底物不能結(jié)合，從而影響底物與酶的催化活性[16]。不僅如此，過高或過低的 pH會造成酶活性中性改變，酯分解作用增強(qiáng)，酯類物質(zhì)減少，因此酶對pH的要求比較嚴(yán)格。研究pH對大曲酯化酶的催化影響有助于掌握其催化規(guī)律，指導(dǎo)白酒生產(chǎn)。

2.2.1 pH對大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影響

圖5 pH對三種香型大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on the enzyme activity of different flavorDaqu in catalyzing and synthesizing ethyl acetate

圖5為pH對三種香型大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影響。從結(jié)果看，隨著pH的升高，三種香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力均是先升高后降低，且均在pH為4.0時活力達(dá)到最大值，此時清香型、濃香型和醬香型大曲酯化酶活力分別為 44.22 mg/g、31.52 mg/g、13.06 mg/g。在pH較低或接近中性時三種大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力都較低，其中濃香型大曲在pH 2.0和7.0時、醬香型大曲在pH≥6.0時，酯化酶活力為負(fù)值，表現(xiàn)為分解作用。

2.2.2 pH對大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影響

圖6 pH對三種香型大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on the enzyme activity of different flavor Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl lactate

三種香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力隨 pH變化的曲線如圖6所示。由圖可看出，隨著pH的升高，三種香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力先升高后降低，其中清香型和濃香型大曲最適pH均為7.0，而醬香型大曲為8.0。在最適pH下，清香型、濃香型和醬香型大曲酯化酶活力分別為 17.42 mg/g、10.49 mg/g、3.38 mg/g。在pH較低時三種大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力都較低，其中濃香型大曲在 pH≤2.0時、清香型和醬香型大曲在 pH≤3.0時，酯化酶活力為負(fù)值，表現(xiàn)為分解作用。

2.2.3 pH對大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影響

圖7 pH對三種香型大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on the enzyme activity of different flavor Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl caproate

pH對三種香型大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影響如圖7所示。從其變化曲線可以看出，隨著pH的升高，三種香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力均是先升后降，清香型、濃香型和醬香型大曲催化合成己酸乙酯最適的pH分別為5.0、4.0、4.5。在高于或低于最適pH時三種大曲催化合成己酸乙酯的酶活力迅速下降，其中濃香型和醬香型大曲在pH 2.0時，酯化酶活力為負(fù)值，表現(xiàn)為分解作用。

2.2.4 pH對大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影響

圖8 pH對三種香型大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影響Fig.8 Effect of pH on the enzyme activity of different flavor Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl butyrate

pH對三種香型大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影響如圖8所示。從結(jié)果看，隨著pH值的升高，三種香型大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力均是先升高后降低，清香型、濃香型、醬香型大曲催化合成丁酸乙酯的最適pH分別為4.5、4.0和3.0。低于最適pH時三種香型大曲的酶活力迅速下降，而高于最適pH時酶活力下降較為緩慢，在pH 2.0和7.0時，三種大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力均為負(fù)值，表現(xiàn)為分解作用。

3 結(jié)論

不同香型大曲由于制曲工藝的差異，所網(wǎng)羅的微生物菌系不同，其酯化酶的催化特性也有所不同。

3.1 清香型大曲催化合成乙酸乙酯和丁酸乙酯的酶活力最大；濃香型大曲催化合成乳酸乙酯和己酸乙酯的酶活力最大；醬香曲催化合成酯類物質(zhì)的酶活力最小。

3.2 一般情況下，較高的底物濃度有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行，但對以酸為底物的酯反應(yīng)而言，酸濃度的提高使反應(yīng)體系的pH下降，而過低的pH影響酯化酶的活性，因此，隨著酸濃度的升高大曲酯化酶活力表現(xiàn)為先升高后降低。通過調(diào)節(jié)高酸濃度下的pH值，可有效提高酯化反應(yīng)的速度。

3.3 酯化反應(yīng)是可逆反應(yīng)，在一定條件下催化酯類物質(zhì)的分解，反應(yīng)液酯含量低于對照，大曲酯化酶活力為負(fù)值。本試驗(yàn)結(jié)果表明，催化合成乙酸乙酯時濃香型大曲在pH 2.0和7.0時、醬香型大曲在pH≥6.0時，酶活力為負(fù)值；催化合成乳酸乙酯時濃香型大曲在pH≤2.0時、清香型和醬香型大曲在pH≤3.0時，酶活力為負(fù)值；催化合成己酸乙酯時濃香型和醬香型大曲在pH 2.0時，酶活力為負(fù)值；催化合成丁酸乙酯時，三種大曲在pH 2.0和7.0時酶活力均為負(fù)值。上述情況的發(fā)生可能存在的原因是：1、特定的pH條件促進(jìn)體系中酯類物質(zhì)的分解作用；2、特定的pH條件抑制體系中乙醇與有機(jī)酸的合成作用。無論是哪種原因?qū)е?，上述結(jié)果均對白酒中酯類物質(zhì)的生成是不利的。

3.4 本研究的結(jié)果表明，各種酯的合成都有其合適酸濃度和pH范圍，如要考慮調(diào)節(jié)酯香物質(zhì)的相對含量，可通過適當(dāng)調(diào)節(jié)酒醅的酸度來實(shí)現(xiàn)。

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