單倍體相合造血干細(xì)胞移植聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療兒童重型再生障礙性貧血的臨床觀察及安全性分析

井遠(yuǎn)方 盧偉 唐湘鳳

重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）是一類骨髓衰竭性疾病且好發(fā)于少年兒童群體，其發(fā)病機(jī)制與造血干細(xì)胞功能缺陷、造血微環(huán)境破壞、免疫損傷等多種病理生理改變有關(guān)[1]。目前異基因造血干細(xì)胞移植是治愈SAA的唯一方法，但多數(shù)患者受到人白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型限制，此時行單倍體相合造血干細(xì)胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，hi-HSCT）為改善患兒預(yù)后質(zhì)量的重要手段[2]。為預(yù)防hi-HSCT后移植物抗宿主病（graft-vs-host disease，GVHD）的發(fā)生，臨床推薦以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）輸注，從而保證治療成功率、降低惡性血液病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[3]。海軍總醫(yī)院兒科于2010年2月至2014年1月，將hi-HSCT聯(lián)合hUC-MSC輸注用于11例SAA患兒的治療，取得了較好的效果，現(xiàn)總結(jié)如下。

資料與方法

一、研究對象

以海軍總醫(yī)院兒科2010年2至2014年1月收治的11例SAA患兒為研究對象，進(jìn)行回顧性分析。患兒均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于SAA的診斷描述[4]，因未找到HLA全相合供者而接受hi-HSCT聯(lián)合hUC-MSC輸注治療，且隨訪時間≥12個月，排除臨床資料不完整者、中途失訪者，以及隨訪期間新加入其它研究者。11例患兒中，男4例，女 7例，年齡 3 ～ 13歲，平均（9.18±3.06）歲，病程 2 ～ 11 年，平均（6.81±2.69）年，其中 2 例既往有免疫治療失敗史，其余9例均為初次接受治療。供者均為親緣供者，其中母供子6例，父供子3例，同胞供者2例；女供男1例，男供女4例，女供女3例，男供男3例。以序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）法確定供受者HLA-A、HLA-B、ABODR位點(diǎn)，其中1個位點(diǎn)不合者2例，2個位點(diǎn)不合者3例，3個位點(diǎn)不合者6例；ABO血型相合7例，主側(cè)血型不合1例，次側(cè)血型不合3例。

二、治療方案

（一）供者干細(xì)胞動員

供者均接受重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhGCSF）皮下注射，每日 1次，每次 5 μg/kg，持續(xù) 5 ～6 d，第5 d于硬膜外麻醉下采集其骨髓干細(xì)胞200 ～600 ml，使用血細(xì)胞分離機(jī)采集外周血干細(xì)胞并經(jīng)靜脈輸注至受者體內(nèi)，根據(jù)外周血干細(xì)胞數(shù)量確定是否實(shí)施二次輸注[5]：需確保有核細(xì)胞（MNC）計(jì)數(shù)≥ 5×108/受者 kg、CD34+計(jì)數(shù)≥ 3×106/受者 kg。

（二）預(yù)處理及hUC-MSC輸注

患兒均于移植前7 d ～移植前2 d接受兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白、環(huán)磷酰胺聯(lián)合Bu預(yù)處理，預(yù)處理方案：兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白10 mg/kg靜脈滴注，每日1次（分4劑）；環(huán)磷酰胺50 mg/kg靜脈滴注，每日1次，持續(xù)4 d；Bu 1.0 mg/kg靜脈泵入，每6 h 1次。移植當(dāng)天回輸供者骨髓，骨髓回輸前6 h予以hUC-MSC靜脈輸注，劑量2 U，細(xì)胞數(shù)1×107/單位，分別于移植后1 d、移植后2 d各輸注供者造血干細(xì)胞，輸注前給予碳酸氫鈉、地塞米松、異丙嗪等藥物處理，并應(yīng)用抗炎、保肝、保護(hù)胃黏膜等藥物治療[6]。

（三）GVHD防治

自移植前7 d起給予環(huán)孢素A靜脈滴注，每周檢測血藥濃度，確保環(huán)孢素A血藥濃度維持在250 ng/ml左右，至胃腸道功能正常后改為口服，移植后180 d逐漸減量，移植后1年若未見GVHD發(fā)生即可停藥。于移植前1 d口服霉酚酸酯，每日1次，每次1 g，持續(xù)至移植后30 ～ 40 d停藥。根據(jù)Gluck Sberg H標(biāo)準(zhǔn)[7]，發(fā)現(xiàn)急性GVHD者，立即給予甲潑尼龍口服治療，每日1次，每次1 ～ 2 mg/kg，起效后逐漸減量并改為強(qiáng)的松口服；若無效則停用環(huán)孢素A，加用他克莫司或CD25單抗治療。發(fā)現(xiàn)慢性GVHD者，給予環(huán)孢素A聯(lián)合強(qiáng)的松治療。

三、觀察指標(biāo)

整理患兒造血重建情況、并發(fā)癥發(fā)生情況以及隨訪結(jié)果，總結(jié)hi-HSCT聯(lián)合hUC-MSC輸注治療兒童SAA的臨床效果與安全性，造血重建情況觀察中，白細(xì)胞植入時間以中性粒細(xì)胞＞0.5×109/L且持續(xù)3 d計(jì)，血小板植入時間以血小板＞20×109/ L計(jì)[8]；以短串連重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（short tandem repeats-polymerase chain reaction，STR-PCR）DNA指紋法，分別于移植后1個月、2個月、3個月及血象好轉(zhuǎn)后檢測干細(xì)胞植入情況，若供受者性別不同，加做染色體核型分析；若供受者血型不同，加做血型滴度檢測[9]。

結(jié) 果

一、造血重建情況

11 例患兒輸入 MNC（6.26 ～ 10.15）×108/kg，CD34（1.91 ～ 10.24）×106/kg，患兒全部獲得造血重建，移植后1個月復(fù)查嵌合體均為70﹪～ 100﹪供者嵌合。白細(xì)胞植入時間8 ～ 21 d，中位時間為12 d；血小板植入時間10 ～ 24 d，中位時間為15 d。移植后1個月STR-PCR及染色體核型、血型檢測均顯示造血干細(xì)胞植入成功，HLA抗原為供者型，血型不合受者ABO血型轉(zhuǎn)變?yōu)楣┱咝汀?/p>

二、并發(fā)癥發(fā)生情況

11例患兒中，2例發(fā)生Ⅰ度急性GVHD，1例發(fā)生Ⅲ度急性GVHD，均經(jīng)相關(guān)治療后好轉(zhuǎn)；1例發(fā)生局限性慢性GVHD，經(jīng)相關(guān)治療后好轉(zhuǎn)；2例發(fā)生廣泛性慢性GVHD，發(fā)生率為18.18﹪。

患兒移植期間均發(fā)生不同程度的惡心、嘔吐、納差和發(fā)熱等癥狀，給予對癥支持治療后好轉(zhuǎn)。8例（72.73﹪）發(fā)生口腔黏膜炎，2例（18.18﹪）發(fā)生肺部感染，9例（81.82﹪）發(fā)生病毒感染，2例（18.18﹪）發(fā)生腹瀉，均經(jīng)綜合治療后好轉(zhuǎn)；1例患兒移植后1個月發(fā)生癲癇，停用環(huán)孢素A并改用他克莫司后癥狀未再發(fā)，隨訪期間病情穩(wěn)定。

三、隨訪情況

11例患兒隨訪時間12 ～ 29個月，中位隨訪時間16個月，截止末次隨訪時1例因廣泛性慢性GVHD接受持續(xù)治療、2例接受免疫抑制劑減量治療，其余4例均停用免疫抑制劑；1例患兒因家屬自行停用環(huán)孢素A發(fā)生排異死亡（表1）。

討 論

異基因造血干細(xì)胞移植是當(dāng)前唯一可治愈SAA的手段，在缺乏合適的HLA全相合供者時，通過hi-HSCT，對于擴(kuò)大干細(xì)胞來源有著重要意義，可為SAA患兒提供生存機(jī)會[10]。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注hi-HSCT在SAA治療中的應(yīng)用，目前臨床廣泛應(yīng)用的非體外去除T細(xì)胞骨髓和外周血混合移植模式，已替代了既往體外去除T細(xì)胞模式，在干細(xì)胞植入劑量、植入成功率、抑制性T細(xì)胞數(shù)量方面也發(fā)揮了巨大優(yōu)勢[11]。同時，為促進(jìn)植入、預(yù)防感染，hUC-MSC輸注的應(yīng)用也愈發(fā)廣泛。

當(dāng)前hUC-MSC在成人SAA患者治療中的安全性與有效性已得到證實(shí)[12]，但關(guān)于兒童SAA治療的安全性仍有待大規(guī)模研究予以明確。此次研究11例患兒接受hi-HSCT聯(lián)合hUC-MSC輸注，其造血重建成功率達(dá)到100﹪，且廣泛性慢性GVHD發(fā)生率僅為18.18﹪，顯現(xiàn)出該方案在確保移植成功率、降低并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)方面的明顯優(yōu)勢。SAA的發(fā)生發(fā)展與造血干細(xì)胞及造血微環(huán)境的改變有關(guān)，與單純外周血干細(xì)胞移植相比，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞更為豐富[13]，而hUC-MSC比來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力更強(qiáng)，且hUC-MSC具有來源廣泛、分離擴(kuò)增簡便、污染少、免疫源性低等特點(diǎn)，被認(rèn)為是更理想的第三方細(xì)胞來源[14]。得益于hUC- MSC的低免疫原特性、多向分化潛能、造血支持和分泌多種生長因子促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控、自我復(fù)制等特點(diǎn)[15]，患兒生存質(zhì)量與預(yù)后質(zhì)量均可得到明顯改善。

表1 11例SAA患兒臨床資料分析

作為供體移植物中T細(xì)胞對受體組織免疫攻擊所引發(fā)的移植后并發(fā)癥，GVHD可對患兒預(yù)后及長期生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，因此，GVHD的預(yù)防是SAA治療中需要重點(diǎn)關(guān)注的環(huán)節(jié)[16]?？紤]到患兒年齡較小，為避免第二腫瘤的發(fā)生，本例采用非照射方案予以預(yù)防，選用經(jīng)典環(huán)磷酰胺、抗人T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白方案的基礎(chǔ)上，旨在預(yù)防GVHD的發(fā)生[17]。除此之外，對于合并骨髓灶性增生活躍的患兒而言，加用Bu以發(fā)揮清髓作用，對于保障患兒平穩(wěn)度過預(yù)處理期、避免嚴(yán)重毒性反應(yīng)甚至預(yù)處理相關(guān)死亡至關(guān)重要[18]。

需要注意的是，雖然11例患兒GVHD發(fā)生率得到了有效控制，但患兒口腔黏膜炎、病毒感染等移植相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率仍處于較高水平，甚至可能是導(dǎo)致患兒無誘因性血象下降、死亡的原因。因此，在今后的臨床實(shí)踐中，移植前應(yīng)完善普外、耳鼻喉、皮膚、眼科、口腔全面檢查，清除全身感染灶；預(yù)處理時應(yīng)給予保護(hù)肝腎、心臟等藥物治療，并注重尿液的堿化、水化，必要時給予美司鈉以預(yù)防出血性膀胱炎；移植后可給予更昔洛韋預(yù)防巨細(xì)胞病毒感染的發(fā)生，同時，對于持續(xù)發(fā)熱超過38 ℃的患兒，需給予經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗生素治療，待藥敏結(jié)果得出后調(diào)整敏感抗生素，以期盡快控制感染，保證移植效果與患兒生存率。

綜上所述，hi-HSCT聯(lián)合hUC-MSC輸注治療兒童SAA的臨床效果與安全性值得肯定，強(qiáng)調(diào)圍移植期的體質(zhì)評估、謹(jǐn)慎選擇預(yù)處理方案、積極處理移植后相關(guān)并發(fā)癥，對于確保移植成功率、提高治療效果、改善患兒預(yù)后質(zhì)量有著重要意義，應(yīng)予以重點(diǎn)關(guān)注。

1 Bernardo ME, Fibbe WE.Mesenchymal stromal cells and hematopoietic stem cell transplantation[J].Immunol Lett, 2015,168(2):215-221.

2 章婧嫽(綜述), 竺曉凡(審校).骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺陷與獲得性再生障礙性貧血[J].中國當(dāng)代兒科雜志, 2015, 17(1):100-106.

3 Lo Iacono M, Anzalone R, La Rocca G, et al.Wharton's jelly mesenchymal stromal cells as a feeder layer for theEx vivoexpansion of hematopoietic stem and progenitor cells: a review[J].Stem Cell Rev,2017, 13(1):35-49.

4 張之南, 沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)-第3版[M].北京: 科學(xué)出版社, 2007:19-23.

5 危薇, 王志東, 鄭曉麗, 等.單倍體相合造血干細(xì)胞移植聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療兒童重型再生障礙性貧血的臨床觀察[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2017, 25(4):1158-1164.

6 Zhuang Y, Li D, Fu J, et al.Comparison of biological properties of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from early and late passages: Immunomodulatory ability is enhanced in aged cells[J].Mol Med Report, 2015, 11(1):166-174.

7 Przepiorka D, Weisdorf D, Martin P, et al.1994 consensus conference on acute GVHD grading[J].Bone Marrow Transplant, 1995, 15(6):825-828.

8 Gao L, Zhang Y, Hu B, et al.Phase II multicenter, randomized, doubleblind controlled study of eff i cacy and safety of umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells in the prophylaxis of chronic graft-versushost disease after hla-haploidentical stem-cell transplantation[J].J Clin Oncol, 2016, 34(24):2843-2850.

9 Fajardo-Ordu?a GR, Mayani H, Montesinos JJ.Hematopoietic support capacity of mesenchymal stem cells: biology and clinical potential[J].Arch Med Res, 2015, 46(8):589-596.

10 王玲.非血緣造血干細(xì)胞聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療兒童重型再生障礙性貧血的療效觀察[D].大連: 大連醫(yī)科大學(xué), 2016:13-16.

11 Zhao Q, Ren H, Han Z.Mesenchymal stem cells:Immunomodulatory capability and clinical potential in immune diseases[J].J Cell Immunother, 2016, 2(1):3-20.

12 葸瑞, 白海, 王存邦.異基因造血干細(xì)胞移植治療重型再生障礙性貧血[J].中國組織工程研究, 2015, 19(6):908-912.

13 王麗, 吳亞妹, 曹永彬, 等.采用改良 FC/ATG 預(yù)處理方案的單倍體相合及 HLA 全相合造血干細(xì)胞移植治療重型再生障礙性貧血的臨床療效分析[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2016, 24(6):1817-1823.

14 De Luca L, Trino S, Laurenzana I, et al.Mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles: a role in hematopoietic transplantation?[J].Int J Mol Sci, 2017, 18(5):1022.

15 Nagamura-Inoue T, Mukai T.Umbilical cord is a rich source of mesenchymal stromal cells for cell therapy[J].Curr Stem Cell Res Ther, 2016, 11(8):634-642.

16 郭智, 陳惠仁, 劉曉東, 等.低強(qiáng)度預(yù)處理聯(lián)合移植后誘導(dǎo)免疫耐受的單倍體相合 Allo-HSCT 治療重型再生障礙性貧血的臨床療效研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2016, 24(6):1811-1816.

17 Squillaro T, Peluso G, Galderisi U.Clinical trials with mesenchymal stem cells: an update[J].Cell Transplant, 2016, 25(5):829-848.

18 Trounson A, Mcdonald C.Stem cell therapies in clinical trials: progress and challenges[J].Cell Stem Cell, 2015, 17(1):11-22.