英山黃花菜葉枯病的病原鑒定及室內(nèi)藥效研究

査中萍 萬正煌 蘇醒 焦春海

摘要：針對英山黃花菜（Hemerocallis citrina）葉部病害的病原菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生物學(xué)特性研究、ITS序列分析以及室內(nèi)藥效試驗。結(jié)果表明，該病原菌為Nigrospora sphaerica，菌絲生長適宜pH為5，最適的碳源是麥芽糖，最適的氮源是酵母浸出液；菌絲生長的致死溫度是55 ℃；在供試的11種藥劑中，以稀釋500倍的50%多菌靈可濕性粉劑和稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對病原菌的抑制效果最佳。根據(jù)病癥，將該葉部病害命名為葉枯病。

關(guān)鍵詞：黃花菜（Hemerocallis citrina）；葉枯?。徊≡b定；藥效鑒定

中圖分類號：S436.44 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0051-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.013

Pathogen Identification and Screening Fungicides of Leaf Streak on Yingshan Daylily

ZHA Zhong-ping1，WAN Zheng-huang1，SU Xing2，JIAO Chun-hai3

（1.Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement， Wuhan 430064，China；2.Seed Management Bureau of Yingshan County，Yingshan 438700，Hubei，China；3.Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： The morphology，biological characteristics，rDNA internal transcribed spacer and screening of fungicides of leaf disease on Yingshan daylily（Hemerocallis citrina） were studied. The results showed that the pathogen was Nigrospora sphaerica.The optimun pH of mycelium growth was 5. The optimal C-source was maltose and the optimal N-source was yeast extract；The lethal temperature of mycelium growth was 55 ℃. According to screening results，prochloraz had the best inhibition on the mycelium growth of the pathogen among the nine tested fungicides. According to the symptom，the disease was named as leaf streak.

Key words： daylily（Hemerocallis citrina）； leaf streak； pathogen identification； screening fungicides

黃花菜（Hemerocallis citrina Baron），又名金針菜、萱草菜，為百合科萱草屬多年生草本植物，是中國特色傳統(tǒng)蔬菜之一。黃花菜富含多種糖類、蛋白質(zhì)、維生素、無機鹽及多種人體必需的氨基酸，其中胡蘿卜素和維生素C含量是西紅柿的5倍，具有抗菌消炎、清熱利濕、明目安神、美容養(yǎng)顏等功效，同時，還具有較好的觀賞價值和保持水土的作用[1]。英山黃花菜是湖北省英山縣的地方品種，以條長肉厚、色澤黃亮、品質(zhì)上乘、營養(yǎng)豐富而聞名。英山黃花菜主要種植區(qū)為英山縣雷家店鎮(zhèn)友誼村，自20世紀(jì)70年代開始，雷家店鎮(zhèn)生產(chǎn)的黃花菜遠(yuǎn)銷多個大中城市，是該鎮(zhèn)農(nóng)副產(chǎn)品中的“拳頭”產(chǎn)品。近年來，黃花菜種植已成為友誼村農(nóng)民脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)，目前友誼村黃花菜種植面積20 hm2以上。5月“第三次全國農(nóng)作物資源普查與收集行動”湖北調(diào)查二隊在湖北省英山縣雷家店鎮(zhèn)友誼村調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該村的黃花菜葉部病害發(fā)生嚴(yán)重，田間發(fā)病率為40%～80%，葉片感病多見于葉尖或葉緣，病斑褐色，后期病斑中間呈深褐色，斑斑相連成條斑，從葉尖向下擴展，使葉片局部枯死。該病每年發(fā)病早，3月上旬開始發(fā)病，不僅嚴(yán)重危害葉片，而且開花期花薹發(fā)病導(dǎo)致花薹枯死折斷，造成整個花薹花蕾絕收，嚴(yán)重影響英山黃花菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前對該病害診斷及防治尚無據(jù)可依。本研究通過對英山縣雷家店鎮(zhèn)友誼村黃花菜葉部病害病原菌的形態(tài)、生物學(xué)特性和病菌的ITS序列分析，確定其種屬地位，并篩選有效藥劑，為該病害防治提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將試驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

利用組織分離法[2]從湖北省英山縣雷家店鎮(zhèn)友誼村黃花菜種植基地黃花菜葉片上分離、純化、保存病菌。

1.2 病原菌形態(tài)觀察和離體回接鑒定

將病菌菌塊先置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）[2]平板中央，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，觀察菌落顏色和形態(tài)；并用無菌水洗下培養(yǎng)菌落中的分生孢子，在顯微鏡（XDS-500倒置顯微鏡）下觀察其形態(tài)。

在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所蔬菜基地選取健康的黃花菜葉片，用自來水沖洗干凈，用75%乙醇棉球輕擦表面。在無菌操作臺上用鑷子輕刮葉片表面，使其形成微創(chuàng)傷，然后用無菌打孔器打取5 mm菌餅置于創(chuàng)傷處，以接培養(yǎng)基的黃花菜葉片為對照。用無菌水打濕無菌紙后放入無菌瓷盤中，將處理好的葉片放在無菌紙上，用保鮮膜包裹瓷盤28 ℃培養(yǎng)。3次重復(fù)，每天觀察并記錄是否發(fā)病。

1.3 菌絲生長的致死溫度和最適pH

取直徑為0.9 cm菌塊于1.5 mL離心管中，在不同溫度梯度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）下水浴10 min后接種于PDA平板。28 ℃培養(yǎng)，3 d后觀察菌絲生長情況，3次重復(fù)。

取直徑為0.9 cm菌塊移到pH 4～11共9個梯度的PDA培養(yǎng)基平板上，平板置于28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，測量菌落直徑，3次重復(fù)。

1.4 不同碳源和氮源對菌絲生長的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用査彼（Czapek）培養(yǎng)基，硝酸鈉2.00 g、氯化鉀0.50 g、硫酸亞鐵0.01 g、磷酸氫二鉀1.00 g、硫酸鎂0.50 g、蔗糖30.00 g、瓊脂17.00 g。碳源用葡萄糖、D-果糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖和可溶性淀粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源；氮源用甘氨酸、酵母浸出液、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、磷酸二氫銨、硝酸銨和L-谷氨酸鈉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源。每個處理設(shè)置3次重復(fù)，28 ℃條件下接菌培養(yǎng)3 d后測量菌落直徑。

1.5 核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的PCR擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用玻璃紙法培養(yǎng)真菌，28 ℃黑暗條件下PDA平板上培養(yǎng)48～72 h，收集菌絲，參照劉少華等[3]報道的尿素法提取菌絲DNA。用真菌特異引物對ITS1/ITS4擴增rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS，Internal transcribed spacer）[4]。堿基序列為ITS1（5′-TCC GTAGGTGAACCTGCGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）。PCR反應(yīng)體系：10 mmol/L的dNTPs 2 μL，20 mmol/L的氯化鎂2 μL，緩沖液2.5 μL，加10 μmol/L的引物ITS1和ITS4各0.5 μL， 2 U/μL的Taq酶1 μL，模板0.5 μL，用去離子水將反應(yīng)體系補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測到600 bp左右的條帶，將PCR擴增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體pGEM-T連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽性菌落擴大培養(yǎng)后，部分菌液用M13（F/R：GTAAAACGACGGCCAG/CAGGAAACAG

CTATGAC）進(jìn)行PCR擴增，凝膠電泳檢測，并將檢測后確認(rèn)含有目的片段的陽性克隆送到華大基因測序公司測序。

將測得的基因序列在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST比較，ITS序列同源性較高的登記菌株作為參比菌株。用CLUSTALX 1.8軟件對相似的序列進(jìn)行多序列比對，由MEGA 5.0軟件采用鄰接法（Neighbor-joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和聚類分析，確定菌株在微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位。

1.6 藥劑抑菌試驗

供試藥劑和使用濃度參照供應(yīng)商推薦的濃度，藥劑均用無菌水配制。采用菌絲生長速率法[5]測定藥劑的抑菌作用，以無菌水為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制帶寬度。每處理重復(fù)4次。

凈生長量=菌落直徑-菌餅直徑

抑制帶寬度=CK凈生長量-處理凈生長量

抑菌率=CK菌落直徑-處理菌落直徑/CK菌落直徑×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)與回接鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長速度較快，菌落近圓形，前期為白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，后期變?yōu)榛野咨粱液稚?8 ℃條件下培養(yǎng)3 d后在顯微鏡下觀察分生孢子，單胞，直徑35 μm左右。病菌接種后2 d，葉片出現(xiàn)病斑，失綠黃化，隨后病斑逐漸擴大；接種5 d，葉片出現(xiàn)典型的病癥，病斑橢圓形，灰白色，病健交界處為灰褐色，具體見圖1。

2.2 菌絲生長的最適pH

由圖2可知，在pH 4、5、6、7、8、9、10、11條件下，菌落平均直徑分別為7.20、7.62、6.95、7.33、6.05、6.30、5.47、3.68 cm。表明菌絲在pH 4～11條件下均能正常生長，生長的最適pH為5，菌絲在pH 11條件下生長速度顯著慢于其他條件下的生長速度。

2.3 不同碳源和氮源對菌絲生長的影響

從圖3可以看出，病菌對碳源的利用率高低表現(xiàn)為麥芽糖>蔗糖>葡萄糖>可溶性淀粉>甘露醇>D-果糖>α-乳糖，其中麥芽糖作為碳源，菌絲生長顯著快于在其他碳源上的生長速度。從圖4可以看出，病菌對氮源的利用率高低表現(xiàn)為酵母浸出液>蛋白胨>硝酸鉀=L-谷氨酸鈉=硝酸鈉>硝酸銨>磷酸二氫銨>硫酸銨=甘氨酸，其中氮源為酵母浸出液時，菌絲生長顯著高于其他氮源生長速度，氮源為甘氨酸或者硫酸銨時，菌絲的生長速度顯著慢于除磷酸二氫銨外其他氮源菌絲的生長速度。

2.4 病原菌的致死溫度

將菌塊置于30、35、40、45、50、55、60、65 ℃水浴10 min，再培養(yǎng)，菌絲在30～50 ℃條件下處理均能正常生長，超過55 ℃病菌不能生長，確定菌絲的致死溫度為55 ℃。

2.5 核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的PCR序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析

利用引物ITS1和ITS4對菌株進(jìn)行PCR擴增，得到大小為515 bp的序列，把所得病菌序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫（GenBank中的序列號：MF996488.1），利用Blast工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知微生物的ITS序列進(jìn)行同源性比對。從圖5可以看出，分離獲得的菌株與Nigrospora sphaerica、Sordariomycetes sp.、Nigrospora chinensis和Nigrospora oryzae聚為一群，但與Nigrospora sphaerica位于同一分支。從分子角度進(jìn)一步確定了該病菌為Nigrospora sphaerica。

2.6 不同殺菌劑的室內(nèi)抑菌作用

由表1可知，稀釋500倍的50%多菌靈可濕性粉劑與稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對病原菌的抑制效果最佳，抑制帶寬度最高，達(dá)到3.15 cm，而對照菌落直徑為3.35 cm，抑制率達(dá)到94.03%。稀釋800倍的50%氯溴異氰尿酸對病原菌沒有抑制效果。在推薦濃度條件下，整體防效表現(xiàn)為多菌靈（苯醚甲環(huán)唑）>木霉菌>甲基硫菌靈>苯甲嘧菌酯>甲霜福美雙>苯甲·丙環(huán)唑>代森錳鋅>噁霉靈>三唑酮>氯溴異氰尿酸，多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、木霉菌、甲基硫菌靈、苯甲嘧菌酯、甲霜福美雙和苯甲·丙環(huán)唑?qū)Σ≡囊种坡示^60%。

3 小結(jié)與討論

英山黃花菜是湖北省英山縣的地方特色品種，雷家店鎮(zhèn)友誼村是英山黃花菜最大的生產(chǎn)基地。由于黃花菜是多年生草本植物，連續(xù)種植使雷家店鎮(zhèn)的黃花菜葉部病害發(fā)病逐年加重，引起了當(dāng)?shù)卣娃r(nóng)民的高度重視，但由于缺乏該病害的診斷特征，因此對該病害的防治無據(jù)可依。英山黃花菜葉部病害由Nigrospora sphaerica引起，基于病癥將該病害命名為黃花菜葉枯病。美國和日本均有Kabatiella microsticta引起的萱草葉枯病嚴(yán)重發(fā)生的報道[6-10]，中國園林工作者也在園林綠化基地發(fā)現(xiàn)K. microsticta引起的萱草葉枯病報道[11]。本研究的N. sphaerica是引起黃花菜葉枯病的一種新的致病菌，該病菌曾引起印度茶樹葉枯病[12]。

英山黃花菜葉枯病病菌在pH 4～11均能生長，該病害的發(fā)生與土壤環(huán)境pH不相關(guān)，因此在雷家店的各田塊都有該病害的發(fā)生。病菌致死溫度為55 ℃，這與在英山縣雷家店鎮(zhèn)的黃花菜在3月中旬開始出土即可受到病害威脅，黃花菜的整個生長季節(jié)該病害都嚴(yán)重發(fā)生直接相關(guān)。病菌在不同成分的培養(yǎng)基上雖然均可生長，但在氮源為甘氨酸或者硫酸銨時，菌絲的生長顯著被抑制。藥效試驗結(jié)果表明，病原菌對多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、木霉菌、甲基硫菌靈敏感。上述研究結(jié)果將為英山黃花菜葉枯病病害發(fā)生規(guī)律及病害防治提供理論依據(jù)。

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