Nanog高表達(dá)可能是急性髓系白血病預(yù)后較好的生物標(biāo)志

周嬌， 湯茜， 張靜， 周凌宇， 翟玲玲， 易云云，易晶， 林江， 錢軍， 鄧兆群*

(1. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 2. 鎮(zhèn)江市精確診斷與治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 3. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

Nanog基因位于12號(hào)染色體12P13.31[1]，最初由Chambers等[2]和Mitsui等[3]在小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。Nanog基因通常被認(rèn)為是一種促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵干細(xì)胞基因。Nanog在NIH3T3細(xì)胞中的致癌潛力主要表現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞生長、病灶形成和集落生長[4]。Nanog基因是乳腺癌[5]、肺癌[6]等許多實(shí)體腫瘤預(yù)后不良因素之一。此外，Nanog還可能促進(jìn)低分化腫瘤及腫瘤耐藥性的形成。

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)由分化障礙和不受控制的異常造血細(xì)胞增殖或積累引起，主要通過骨髓和外周血的形態(tài)學(xué)檢查明確診斷[7]。雖然AML的治療方案很多，但5年總生存率低于50%，老年患者診斷后2年內(nèi)僅20%存活[8-9]。近年來，分子學(xué)異常與疾病預(yù)后的關(guān)系越來越受到關(guān)注，而Nanog是否影響AML患者預(yù)后的報(bào)道尚不多見。

目前認(rèn)為，SOX2基因與腫瘤的侵襲性表型和不良預(yù)后相關(guān)[10-11]，但有研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中，高表達(dá)SOX2基因的患者較低表達(dá)患者有相對(duì)好的預(yù)后。由此，其他基因在腫瘤中的表現(xiàn)是否可能與SOX2相似仍需要更深入的研究。

本研究檢測了初診AML患者中Nanog基因的表達(dá)水平，并通過分析臨床資料以確定Nanog與AML患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來源

146例初診AML患者治療前骨髓標(biāo)本以及其中11例治療后完全緩解患者隨訪骨髓標(biāo)本，均取自于2003年6月至2015年7月期間在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液內(nèi)科獲得診斷并接受治療的病例。另以來自骨髓捐獻(xiàn)者或胸外傷患者的31份健康骨髓樣本作為對(duì)照標(biāo)本。隨訪患者均接受了長期標(biāo)準(zhǔn)化治療，并達(dá)到完全緩解?；颊叩脑\斷和分型依據(jù)FAB分型和2008年WHO標(biāo)準(zhǔn)。每位患者的治療計(jì)劃、相關(guān)檢查報(bào)告及疾病情況均記錄在各自的醫(yī)囑單和病歷上，病歷均完整留存于病案室。另外，所有骨髓標(biāo)本捐獻(xiàn)者均簽署了知情同意書。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查

用直接法和24 h短期培養(yǎng)法常規(guī)制備骨髓細(xì)胞染色體并分析R顯帶核型，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)》，依據(jù)染色體和預(yù)后的關(guān)系，將患者分為3個(gè)組別：低危組、中危組及高危組。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞分離、RNA制備、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

抽取骨髓并使用肝素抗凝，使用Ficoll分離出AML患者和健康供體的單個(gè)核細(xì)胞，此后用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從單個(gè)核細(xì)胞中分離總RNA，再利用隨機(jī)引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測Nanog mRNA的表達(dá)

Nanog的引物序列是5′-CTCCTCTTCCTCTAT-ACTAACATG-3′(正向)和5′-AGAATCAGGGCTGTC-CTGAATAAG-3′(反向)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)均在實(shí)時(shí)定量PCR儀(7500 Thermo cycler，美國APPlied Biosystems公司)上進(jìn)行，擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃10 s，53 ℃ 30 s和72 ℃ 32 s，45個(gè)循環(huán)，以無菌超純水作為陰性對(duì)照。在實(shí)施PCR后，進(jìn)行解鏈曲線分析以證明PCR產(chǎn)物作為單峰的特異性。通過以下公式計(jì)算Nanog轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)水平：NNanog=(ENanog)ΔCT Nanog (對(duì)照-實(shí)驗(yàn))÷(EABL)ΔCT ABL(對(duì)照-實(shí)驗(yàn))。參數(shù)效率(E)通過公式E=10(-1/斜率)計(jì)數(shù)(斜率參照CT對(duì)cDNA濃度圖)。按照文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法，通過高分辨率熔解分析檢測Nanog突變，利用DNA直接測序確認(rèn)陽性樣品。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件實(shí)施。利用卡方檢驗(yàn)及方差檢驗(yàn)來比較分類變量之間的差異，以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組連續(xù)變量之間的差異。使用受試者工作特征(ROC)曲線和ROC曲線下面積分析Nanog表達(dá)對(duì)AML的診斷價(jià)值。采取生存分析(Kaplan-Meier)和多因素分析評(píng)估不同水平的Nanog表達(dá)對(duì)AML患者生存的影響。所有結(jié)果均以雙尾P值<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初診AML患者Nanog mRNA的表達(dá)

初診AML患者Nanog mRNA表達(dá)水平(0.0002～136.307，中位數(shù)0.263)明顯高于健康對(duì)照組(0.0012～3.593，中位數(shù)0.084，P<0.01)；非低危組Nanog mRNA表達(dá)明顯高于低危組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Nanog mRNA在AML患者中的相對(duì)表達(dá)量

表1 不同風(fēng)險(xiǎn)水平組中Nanog mRNA的表達(dá)

2.2 Nanog表達(dá)的高低分組

AML患者Nanog mRNA表達(dá)的ROC曲線下面積為0.644(95%CI0.556～0.731，P=0.012；圖2)。敏感性和特異性分別為46.9%和87.1%，因此，Nanog表達(dá)的截止值為0.324。按照此截?cái)嘀?，將AML患者分為高表達(dá)組(≥0.324)、低表達(dá)組(<0.324)。

2.3 Nanog表達(dá)與AML患者臨床資料特征的相關(guān)分析

通過分析臨床資料顯示，Nanog高表達(dá)組與低表達(dá)組間在性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例、FAB分型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。 染色體分析結(jié)果顯示，高表達(dá)Nanog主要出現(xiàn)在非低危組(78%，P=0.027)。8個(gè)基因突變(CEBPA，NPM1，F(xiàn)LT3-ITD，c-KIT,N/K-RAS，IDH1/2，DNMT3A，U2AF1)在Nanog高、低表達(dá)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 急性髓系白血病患者Nanog表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.4 Nanog表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系

146例初發(fā)AML患者均按照白血病治療指南接受了標(biāo)準(zhǔn)治療。全部患者的中位隨訪時(shí)間為7.00個(gè)月，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示高表達(dá)組的生存時(shí)間(95%CI4.775～15.225，中位數(shù)10個(gè)月)比低表達(dá)組(95%CI4.45～9.55，中位數(shù)7個(gè)月)長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.484)。見圖3。

然而，在非M3患者中，低表達(dá)組的生存時(shí)間有短于高表達(dá)組的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.126)。在非低危組患者中，Nanog高表達(dá)組患者(95%CI5.876～16.124，中值為11個(gè)月)存活時(shí)間明顯比低表達(dá)組患者(95%CI2.551～5.449，中值4個(gè)月)更長(P=0.031)。見圖3。

圖2 利用ROC曲線確定Nanog表達(dá)的截止值

圖3 Nanog表達(dá)對(duì)AML患者總生存期的影響

我們還檢測了11例得到隨訪患者的樣本，結(jié)果顯示，AML患者完全緩解后的Nanog表達(dá)水平明顯高于初診時(shí)的表達(dá)水平(P=0.002)。見圖4。

多因素分析結(jié)果顯示，以白細(xì)胞計(jì)數(shù)(≥30×109/L與<30×109/L)、血紅蛋白(<110 g/L與≥110 g/L)、年齡(<60歲與≥60歲)，血小板計(jì)數(shù)(<100×109/L與≥100×109/L)，染色體分型(低危與非低危)，基因突變(突變與野生型)和Nanog表達(dá)狀態(tài)(高與低)等作為協(xié)變量，顯示Nanog表達(dá)是影響AML患者預(yù)后的獨(dú)立因素。見表3。

圖4 11例隨訪患者Nanog mRAN表達(dá)水平

表3 多因素分析非低危組患者和AML患者的總生存預(yù)后因素

3 討論

WHO分型將AML患者分為不同的風(fēng)險(xiǎn)群組(低危，中危，高危)[13]。不同的群組有著不同的預(yù)后，如利用現(xiàn)有的治療方案，t(8; 21)和inv(16)染色體重排的AML患者通常可以接受蒽環(huán)類和阿糖胞苷誘導(dǎo)化療以達(dá)到完全緩解[14]。

Nanog是一個(gè)獨(dú)特的同源結(jié)構(gòu)域蛋白，其基因與其他核心胚胎轉(zhuǎn)錄基因的分類(OCT4和SOX2)一致[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)SOX2基因在一些實(shí)體腫瘤，如肺癌、頭頸部癌、食管癌、乳腺癌、胃癌和結(jié)腸癌等[17-22]中過表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲性表型和不良預(yù)后相關(guān)[23-27]。然而Wilbertz等[28]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SOX2基因的肺鱗狀細(xì)胞癌患者有著較好的預(yù)后，認(rèn)為SOX2基因可能在正常鱗狀細(xì)胞前體細(xì)胞中過度表達(dá)，從而消除混亂的惡性去分化。另外，由于基因失活，SOX2表達(dá)水平在早期肺鱗狀細(xì)胞癌中增加，而在疾病進(jìn)展期間可能減少[28]，Velcheti等[29]對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的研究也顯示了類似結(jié)果。在本研究也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即使Nanog是許多實(shí)體瘤中的致癌基因[5-6]，而本研究非低危組中高表達(dá)Nanog的AML患者同樣有著良好的預(yù)后，我們還分析了Nanog在隨訪患者標(biāo)本中的表達(dá)，包括初診及其相對(duì)應(yīng)的完全緩解的標(biāo)本預(yù)后。因此，我們推測，在腫瘤中過表達(dá)的基因可能并不全是致癌基因。

本研究146例AML患者中存在Nanog過度表達(dá)的趨勢(shì)，且生存分析顯示高表達(dá)組生存時(shí)間長于低表達(dá)組(P=0.484)，然而，這個(gè)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過分析原因，我們認(rèn)為這樣的結(jié)果可能是由于標(biāo)本量較少所致。而另一方面，Nanog不僅在AML患者中表達(dá)較高，在非低危組患者中更是如此。生存分析顯示，Nanog高表達(dá)組患者生存期有長于低表達(dá)組患者的趨勢(shì)。這個(gè)結(jié)果與以往認(rèn)為Nanog是癌癥不良因素的研究[5-6]結(jié)論相反。此外，在非M3患者中，高表達(dá)組的患者總體生存趨勢(shì)較低表達(dá)組長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.126)。我們推測造成這種現(xiàn)象的原因可能是樣本數(shù)量太少而不能代表整體情況。我們還發(fā)現(xiàn)，在非低危組患者中，低表達(dá)組的患者預(yù)后較差。根據(jù)我們的結(jié)果，可以認(rèn)為，Nanog高表達(dá)是非低危組AML患者預(yù)后良好的生物學(xué)標(biāo)志。此外，多因素分析也顯示Nanog表達(dá)是影響AML患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

為了求證Nanog是否為AML患者預(yù)后良好的生物學(xué)標(biāo)志，我們還比較了患者初診和完全緩解后的骨髓標(biāo)本中Nanog的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)初診樣本的Nanog表達(dá)量低于所對(duì)應(yīng)的完全緩解后的樣本。

這樣的情況不僅僅在我們的研究中存在，在其他研究中也一樣[30]。例如，盡管Twist1被認(rèn)為是乳腺癌、胃癌、前列腺癌和鼻咽癌的侵襲性轉(zhuǎn)移性因子[31-34]，但Twist1高表達(dá)的AML患者總體生存時(shí)間反而較長[30]。為了解釋這個(gè)現(xiàn)象，Chen等[30]使用兩種標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)化療劑阿糖胞苷或柔紅霉素來處理AML細(xì)胞系，以研究細(xì)胞系對(duì)這兩種藥物的敏感性。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，過表達(dá)Twist1的KG1a細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷的治療更敏感；另外他們還發(fā)現(xiàn)，Twist1可以通過抑制P14ARF和P16INK4A的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，使白血病細(xì)胞更容易受到特異性化療藥阿糖胞苷的細(xì)胞毒作用。因此，高表達(dá)Twist1的AML患者對(duì)治療的反應(yīng)率更高，且存活率更高[30]。因此，我們推測，類似的生物學(xué)機(jī)制可能也存在于Nanog對(duì)AML患者的影響之中，但尚需更深入的研究證實(shí)。

正如前面提到的許多研究顯示，Nanog是腫瘤患者的不良預(yù)后因子，而影響腫瘤患者預(yù)后的不單單只有基因型，患者的生活環(huán)境、性別、年齡、基礎(chǔ)疾病以及身體狀況以及其他一些生物學(xué)機(jī)制也可能會(huì)影響預(yù)后。一些研究認(rèn)為，Nanog的基礎(chǔ)水平對(duì)于癌細(xì)胞增殖可能是必需的，并且可部分增加Nanog介導(dǎo)的克隆形成和成瘤性質(zhì)；但過度表達(dá)的Nanog可能并不是在所有條件下均促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[35]。我們認(rèn)為，不同的結(jié)果可能取決于不同的細(xì)胞類型，以及與腫瘤微環(huán)境中的其他因素的不同組合，但均需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上，我們推測Nanog是一個(gè)判斷AML預(yù)后的生物學(xué)新標(biāo)志物，可預(yù)測非低危組患者的預(yù)后。

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