受母性影響的油菜種子性狀研究

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(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所， 昆明 650205；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)社會(huì)服務(wù)辦公室, 昆明 650201； 4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 昆明 650201)

油菜是四大主要油料作物之一，在世界油料作物中發(fā)揮著舉足輕重的作用，油菜籽全球總產(chǎn)僅次于大豆[1]，同時(shí)油菜也是植物蛋白質(zhì)飼料來源[2]。研究表明，作物正反交種子的某些性狀會(huì)產(chǎn)生差異，是由于受母體植株基因型的影響和卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。E.Millet等在研究小麥正反雜交過程中發(fā)現(xiàn)，其籽粒蛋白質(zhì)的含量受母體效應(yīng)的影響[3]。Singh等認(rèn)為，大豆籽粒蛋白質(zhì)含量具有較強(qiáng)的母體效應(yīng)[4]。Brim等研究發(fā)現(xiàn)，大豆籽粒油分含量也具有較強(qiáng)的母體效應(yīng)[5]。D.G.Dan等在棉花雜交中發(fā)現(xiàn)，種子的含油量存在母體效應(yīng)，而且母體效應(yīng)高于基因遺傳效應(yīng)[6]。目前，關(guān)于油菜種子性狀的遺傳控制研究還較少，僅王新發(fā)[7]對(duì)甘藍(lán)型油菜種子含油量進(jìn)行了研究。為此，本研究選取種子含油量、大小等性狀差異顯著的2個(gè)甘藍(lán)型油菜DH系進(jìn)行正反交，并對(duì)正反交種子進(jìn)行性狀比較分析，旨在探索油菜種子性狀的遺傳控制機(jī)制，為解析其分子機(jī)制提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

親本材料為甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)品系DH 0729和DH 0216，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 材料種植

為了使2個(gè)親本花期相遇，進(jìn)行不同時(shí)期播種，種植在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)地。2016年10月5日播種DH 0729，2016年10月15日播種DH 0216，后期進(jìn)行油菜常規(guī)栽培管理。

1.2.2 人工去雄與授粉

選擇生長(zhǎng)健壯無病蟲害的植株為試驗(yàn)對(duì)象。父本于授粉前3 d摘除已開放的花蕾，并套袋隔離。于授粉前1 d摘除母本主花序上已開放花蕾及上部較小的花蕾，保留5～7個(gè)較大的將要開放的花蕾進(jìn)行人工去雄，然后套袋隔離，并掛牌標(biāo)記。于次日09：00—11：00時(shí)用棉簽將父本花粉授在母本柱頭上，并立即套袋隔離。以DH 0729為母本，DH 0216為父本配制正交組合，記為DH 29-16。以DH 0216為母本，DH 0729為父本配制反交組合，記為DH 16-29。成熟時(shí)收獲種子，并統(tǒng)計(jì)角果數(shù)。

1.2.3 種子形態(tài)性狀的測(cè)定

種子大小以千粒重、直徑計(jì)量。用千分之一電子分析天平隨機(jī)稱量1 000粒種子的重量，重復(fù)3次。用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量種子直徑，每次測(cè)量50粒種子，重復(fù)3次。在體視顯微鏡下將種皮、子葉、胚剝離開，每次50粒種子，然后分別稱量種皮、子葉、胚的重量，重復(fù)3次。

1.2.4 含油量的測(cè)定方法

將除去雜質(zhì)干凈的油菜種子寄到河南大學(xué)河南省植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，用丹麥 Foss 公司NIR 5000型近紅外光譜分析儀測(cè)定種子的含油量和幾種常見脂肪酸的含量及硫甙的含量。

1.2.5 種子不同組織的含油量測(cè)定

分別稱取0.2 g種皮、子葉、胚放入玻璃離心管中，在65 ℃烘箱中處理1周，完全烘干脫水后轉(zhuǎn)入研缽中，加液氮充分研磨成粉末，然后將粉末全部轉(zhuǎn)移至玻璃提油管中，加800μL的正己烷/異丙醇(3∶2)提取液，靜置1 min后在渦旋儀上振蕩混勻10 min，然后3 000 r/min離心8 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一已稱重的提油管中，并再在沉淀中加入500μL正己烷/異丙醇(3∶2)提取液，在渦旋儀上振蕩混勻10 min，3 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清并合并兩上清液，真空干燥，然后稱重，減去管重即獲得油脂重量。每種組織重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜正反交結(jié)角果率的差異

對(duì)油菜正反交的結(jié)角果率進(jìn)行分析，結(jié)果(表1)表明，正反交的結(jié)角果率有一定的差異，正交的結(jié)角果率為85.9%，反交的結(jié)角果率為77.1%，反交的結(jié)角果率要低于正交的結(jié)角率。理論上同一物種不同品種或品系間雜交不會(huì)存在授粉和結(jié)實(shí)的差異，但在本研究中正反交結(jié)角果率表現(xiàn)出差異，可能是由于在人工授粉去雄過程有一些花蕾的柱頭或子房受到了損傷，使授粉到柱頭上花粉不能很好地萌發(fā)和受精，導(dǎo)致角果發(fā)育不正常而脫落。

表1 正反雜交組合結(jié)角果率

雜交組合授粉花蕾總數(shù)(個(gè))成熟角果數(shù)(個(gè))結(jié)角果率(%)DH29-1652144885.9DH16-2958645277.1

2.2 油菜正反交種子大小的差異

對(duì)親本以及正反交種子千粒重進(jìn)行分析，結(jié)果(圖1)表明，親本千粒重差異顯著，親本DH 0729的千粒重為5.074 0 g，親本DH 0216的千粒重為3.301 1 g。但其正反交種子千粒重差異不明顯，正交種子千粒重為6.060 4 g ，反交種子千粒重為5.998 9 g。對(duì)親本及正反交種子的直徑進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律。2個(gè)親本的種子直徑差異明顯，DH 0729

表2 種皮、子葉、胚占種子的占比(單位：%)

品種種皮子葉胚子葉+胚DH072916.45±0.3707b70.58±0.2316a10.76±0.6463d81.01±0.3356bDH021618.32±0.1708a63.46±1.3639c17.05±0.9027a81.64±1.8887bDH29-1616.69±1.416b68.78±1.6991a11.18±0.8650c82.30±1.7494aDH16-2916.97±0.4809a66.70±0.1301b15.17±0.7267b83.97±0.4915a

表3 種子各種脂肪酸差異分析(單位：%)

品種油酸亞油酸亞麻酸芥酸飽和脂肪酸DH072959.83±0.34b20.84±0.43a8.55±0.44b11.58±0.57a7.24±0.07aDH021663.53±0.79a17.58±1.01b7.64±1.13c11.25±1.38a6.69±0.03bDH29-1660.94±0.69a18.30±0.24a8.73±0.16b11.79±0.10a7.38±0.03aDH16-2957.93±1.76b18.88±1.10a10.02±0.58a11.93±1.39a6.74±0.05b

表4 種子不同組織含油量分析(單位：%)

品種種子含油量種皮子葉胚DH072937.47±0.76b2.87±0.10b33.65±2.68b36.30 ±1.79aDH021646.20±1.16a1.91±0.15c42.40±2.35a37.06±1.32aDH29-1638.11±0.22b2.70±0.17a35.42±1.71b34.75 ±1.72aDH16-2946.66±1.86a2.15±0.15c42.15 ±1.75a36.77±1.44a

種子的平均直徑為2.005 9 mm，屬于大種子，DH 0216種子的平均直徑為1.221 5 mm，屬于小種子。而正反交種子直徑的差異不顯著，正交種子的平均直徑為2.260 1 mm，反交種子的平均直徑為2.136 9 mm。由此可見，不論是正交，還是反交，種子大小并未表現(xiàn)出偏向性，不受母體效應(yīng)(基因型)的影響。正反交種子的大小均大于最大的親本，并且差異顯著，這是由于在進(jìn)行雜交時(shí)每個(gè)花序只保留了5～7朵花，有充足的營養(yǎng)供應(yīng)角果和種子發(fā)育之需要。另外，正反交雜種子的成熟期延緩，增加了種子發(fā)育和灌漿的時(shí)間，從而使正反交種子的千粒重和直徑顯著地增加。

2.3 油菜種子不同組織的占比分析

對(duì)油菜種子不同組織的占比進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)表明，在油菜種子中，子葉占比在60%以上，而種皮和胚的占種比較小，均在20%以下。種皮、子葉以及葉+胚的占比在親本和正反交種子中差異都不明顯，而且正反交的也沒明顯地表現(xiàn)出偏母性。但胚的占比在2親本之間及正反交之間差異顯著，而且表現(xiàn)出明顯的偏母性，母本占比低的其后代的占比也低，母本占比高的其后代得占比也較高，說明胚的占比存在母體效應(yīng)。

2.4 種子含油量與脂肪酸組成的差異分析

利用近紅外儀對(duì)親本和正反交種子的含油量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)正反交種子的含油量差異顯著，母本含油量高的，其雜交種子的含油量也高；母本含油量低的，其雜交種子含油量也低，說明油菜種子含油量存在明顯母體效應(yīng)，具有偏母性。采用重力法對(duì)種子不同組織的含油量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)種皮的含油量普遍較低,為2%左右，而子葉和胚的含油量較高，均在30%以上，說明油脂主要在子葉和胚中累積。此外，正反交種子的種皮、胚的含油量差異不明顯，沒有呈顯出偏母性，而正反交種子的子葉含油量差異顯著，并呈現(xiàn)出偏母性。這說明正反交種子含油量的偏母性是由子葉含油量的偏母性決定的，是由于子葉的含油量比較高，特別是子葉在種子中的占比表現(xiàn)特別高，達(dá)到70%。雖然胚的含油量較高，但由于其在種子中的占比表現(xiàn)特別低，不到20%，因此，不會(huì)影響到種子含油量的偏母性。但在本研究中所測(cè)得的油菜種子不同組織的含油量都低于整個(gè)種子含油量，這主要與測(cè)定方法有關(guān)，因?yàn)樵诮M織含油量的測(cè)定過程中有一定的油脂損失，如組織粉末轉(zhuǎn)移不完全或油脂抽提不完全等。

圖1 種子千粒重顯著性比較

圖2 種子的直徑顯著性分析

利用近紅外儀測(cè)定了親本和正反交種子幾種主要脂肪酸的含量，發(fā)現(xiàn)油酸、亞麻酸、飽和脂肪酸的含量在親本間存在一定的差異，在正反交種子間同樣也存在一定的差異，但并未呈現(xiàn)出偏母性。而亞油酸含量在親本間存在一定的差異、但在正反交種子間沒有差異。僅芥酸含量在親本、正反交種子間差異不明顯，這可能與它們均為雙低油菜、其芥酸基因隱性純合有關(guān)。

3 討 論

油菜種子性狀的遺傳機(jī)制研究，有利于遺傳高產(chǎn)育種。本研究發(fā)現(xiàn)，正反交種子千粒重、直徑都顯著大于親本。王杰利在對(duì)甘藍(lán)型營養(yǎng)分配研究過程中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)分配調(diào)控可以使油菜主花序角果收獲的種子千粒重增加，最高可以增加1倍左右[8]，本研究結(jié)果與之相符。楊光等研究發(fā)現(xiàn)，油菜正反雜交后能導(dǎo)致種子胚的干重略微增加[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，正反雜交子葉和胚總重比均略大于親本，但是胚/種比具有明顯偏母性，而種皮和子葉占比無明顯的偏母性，而前人未見研究和報(bào)道。同時(shí)對(duì)油菜種子的組分分析發(fā)現(xiàn)，油菜種子大小差別主要來自于子葉占整個(gè)種子的比，子葉占種比越大種子就越大。

本研究發(fā)現(xiàn)，正反交種子及組分中子葉含油量具有明顯偏母性，而種皮、胚的含油量未表現(xiàn)出偏母性。韋存虛等在對(duì)油菜種子不同組織的油體進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，種子子葉細(xì)胞大部分區(qū)域都被油體所充實(shí)[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，油菜的油脂主要儲(chǔ)存在子葉中。對(duì)種子不同組織的占比和含油量分析發(fā)現(xiàn)，種子中子葉/種比遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胚/種比，雖然子葉和胚在種子中含油量相差不大，但是胚/種比明顯低于子葉/種比，說明油菜正反交種子含油量高低主要是其子葉大小和含油率共同決定。但是目前對(duì)于油菜正反交種子含油量偏母性的調(diào)控機(jī)制還不清楚。王通強(qiáng)在對(duì)甘藍(lán)型油菜的雜交后代種子含油量的遺傳做了部分研究，發(fā)現(xiàn)后代種子含油量與母體含油量呈顯著正相關(guān) , 而與父本含油量則無明顯相關(guān)性[11]。同時(shí)油菜種子含油量屬于多基因控制的數(shù)量性狀，較易受到外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致含油量差異性。作為油料作物，油菜種子在發(fā)育過程中，物質(zhì)的積累比較復(fù)雜，涉及糖和脂肪累積2個(gè)不同階段，在中間代謝方面會(huì)受到大量調(diào)節(jié)因素的控制，使得含油量遺傳調(diào)控變得極其復(fù)雜[12]，因此對(duì)含油量調(diào)控解析進(jìn)展緩慢，對(duì)于正反交導(dǎo)致含油量的差異和偏母性原因至今沒有很好的解釋。

種子含油量大小由種子千粒重和含油率構(gòu)成。因此,在以后油菜育種過程中，可以通過植株角果合理的營養(yǎng)分配提高種子千粒重，在分子水平對(duì)子葉含油率進(jìn)行調(diào)控，最終達(dá)到增加油菜種子產(chǎn)油量的目的，從而培育出超高產(chǎn)油菜新品種。

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