益母草堿在大鼠急性內(nèi)毒素性葡萄膜炎 模型中的保護(hù)作用

熊佳偉 顧紀(jì)鋒 石碗如 吳甦潛 麥爾哈巴·肖開(kāi)提 朱依諄 莫曉芬△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科, 2藥劑科 上海 200031; 3澳門科技大學(xué)藥學(xué)院 澳門 999078;4復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)與生物化學(xué)教研室 上海 201203)

益母草堿(leonurine,SCM-198)作為益母草主要活性成分之一,最初因其在心腦血管系統(tǒng)疾病中能夠發(fā)揮抑制血小板聚集、降低外周血管阻力、減輕氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)L型Ca2+通道活性等作用而受到關(guān)注[1-3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),它還能通過(guò)下調(diào)TLR4及NF-κB活化,影響一系列下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在全身多種炎癥性疾病中發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用,且無(wú)明顯不良反應(yīng)[4-6]。眼科多種疾病(如葡萄膜炎等)均與炎癥關(guān)系密切。由于血-房水屏障(blood-aquaous-barrier,BAB)、血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retina-barrier,BRB)等血-眼屏障的存在,全身給藥的抗炎治療效果不明顯、不良反應(yīng)大,而局部治療(如眼內(nèi)注射等)又存在并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題,故亟需尋找抗炎作用穩(wěn)定、給藥方便、不良反應(yīng)可控的新藥。SCM-198在急性乳腺炎、急性腎損傷等動(dòng)物模型的前期研究中已被證實(shí)具有穩(wěn)定的抗炎作用[5-6],且作為小分子化合物,其可透過(guò)血-眼屏障,由此帶來(lái)其在眼科疾病治療方面潛在的應(yīng)用前景。本研究系首次在葡萄膜炎大鼠模型上開(kāi)展益母草堿作用的研究,通過(guò)灌胃方式給藥,研究了 SCM-198在SD大鼠急性內(nèi)毒素性葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)模型中的保護(hù)作用,并初步探討可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

動(dòng)物、主要試劑及儀器SPF級(jí)雄性SD大鼠36只(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司),初始體重180～200 g。0.9% NaCl注射液(浙江天瑞藥業(yè)有限公司);地塞米松磷酸鈉注射液(山東辰欣藥業(yè)股份有限公司);SCM-198(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院朱依諄教授課題組惠贈(zèng));甲苯塞嗪鹽酸鹽(美國(guó)Sigma Aldrich公司);鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司);S.typhiLPS(美國(guó)Sigma Aldrich公司);TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1一抗,對(duì)應(yīng)二抗(英國(guó)Abcam公司),BCA試劑盒(美國(guó)Sigma Aldrich公司)。33 Ga顯微注射器(瑞士Hamilton公司);Espion E2小動(dòng)物ERG檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Diagnosys公司);眼科顯微手術(shù)系統(tǒng)(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)。

實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)記錄體重后將全部大鼠隨機(jī)分為3組:陰性對(duì)照組6只,每日0.9% NaCl注射液10 mL/kg體重灌胃;陽(yáng)性對(duì)照組6只,每日50 mg/L地塞米松磷酸鈉溶于生理鹽水注射液10 mL/kg體重灌胃;實(shí)驗(yàn)組4個(gè)亞組、每個(gè)亞組6只,分別以每日每千克體重10、20、40、80 mg的SCM-198生理鹽水灌胃。共21天,組間飼養(yǎng)無(wú)差異,其間每7天記錄體重。第18天灌胃結(jié)束后,各組大鼠以加入0.018 75 g/mL甲苯塞嗪鹽酸鹽的0.05 g/mL鹽酸氯胺酮注射液4 mL/kg體重腹腔注射麻醉、充分暗適應(yīng)(2 h)后行ERG檢測(cè);第21天灌胃后以1 g/L的傷寒沙門氏菌(S.typhi) LPS生理鹽水溶液0.1 mL于全部大鼠左足底注射建立EIU模型[7],造模后24 h再次如上麻醉并行ERG檢測(cè);之后由2位有經(jīng)驗(yàn)的眼科醫(yī)師于雙盲下行裂隙燈下雙眼炎癥評(píng)分[8],方法如表1,33 Ga顯微注射器于手術(shù)顯微鏡下取左眼房水(-80 ℃保存)后處死動(dòng)物。即刻取右眼眼球,固定后石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下圖像采集觀察,留取白片,免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色檢測(cè)TNF-α、ICAM-1的表達(dá)。對(duì)留取的房水解凍、BCA法測(cè)定蛋白濃度,Western blot檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表達(dá)。

表1 大鼠葡萄膜炎臨床評(píng)分指標(biāo)Tab 1 Scoring system for clinical evaluation of uveitis [8]

結(jié) 果

TimeSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative control Positive control Before235±27235±28235±32221±29230±29234±277th day274±19277±11272±34255±49260±29216±2914th day269±31286±27276±32268±53271±37209±2621st day265±25296±32277±27285±54278±34188±16

ItemSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative controlPositive controlOS3.29±1.073.50±1.243.25±1.983.00±1.763.36±1.801.75±0.89OD3.21±1.373.50±1.243.38±1.773.10±1.793.27±1.901.88±1.13

OS:Oculus sinister;OD:Oculus dexter.

圖1 各組大鼠虹膜睫狀體(A)和玻璃體視網(wǎng)膜(B) HE染色結(jié)果Fig 1 The HE staining results of iris and ciliary body (A),retina and vitreous (B) in rats

圖2各組大鼠TNF-α(A)和ICAM-1(B)IHC檢測(cè)結(jié)果
Fig2TheIHCresultsofTNF-α(A)andICAM-1(B)inrats

圖3各組大鼠房水Westernblot結(jié)果
Fig3TheWesternblotresultsofaqueoushumorinrats

討 論

與炎癥相關(guān)的眼部病變是不可逆性致盲的重要原因,如葡萄膜炎,好發(fā)于中青年人群,多與自身免疫因素相關(guān)、可伴或不伴全身疾病,可復(fù)發(fā)緩解,臨床治療較為棘手?；A(chǔ)和臨床研究亦證實(shí),糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病過(guò)程中,長(zhǎng)期低度炎癥反應(yīng)刺激是病情進(jìn)展的重要原因[9-10]。傳統(tǒng)抗炎治療以激素、免疫抑制劑等藥物為主,局部或全身應(yīng)用均有較為明顯的不良反應(yīng),眼部長(zhǎng)期應(yīng)用激素可致激素性青光眼、白內(nèi)障,免疫抑制劑局部應(yīng)用刺激性較強(qiáng);全身應(yīng)用激素可致體型改變、骨質(zhì)疏松、消化道潰瘍等,免疫抑制劑長(zhǎng)期應(yīng)用影響生育功能、升高惡性腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)等。綜上,傳統(tǒng)藥物治療炎癥相關(guān)性眼病受到較大限制。本研究中,雖然地塞米松能在EIU模型大鼠中發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎作用,但該組大鼠處于高分解代謝狀態(tài)、體重顯著減輕且顯著低于其他各組,存在明顯不良反應(yīng),該項(xiàng)結(jié)果也與既往研究結(jié)果一致。造模前ERG檢測(cè)結(jié)果顯示,各組大鼠視網(wǎng)膜功能未見(jiàn)異常,亦未見(jiàn)其他不良反應(yīng),可見(jiàn)SCM-198和地塞米松以本研究所用劑量灌胃21天,眼部安全性良好。

SCM-198近年來(lái)被證實(shí)可在多器官、系統(tǒng)中發(fā)揮明顯的抗炎作用。其作用機(jī)制主要有兩種途徑,一是以直接下調(diào)TLR4活化為核心,TLR4廣泛存在于巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表面,下調(diào)其活化可降低多種炎癥介質(zhì)表達(dá)[5,11-12];二是以下調(diào)NF-κB活性為核心,進(jìn)而下調(diào)IκB水平,抑制PI3K/Akt、ERK/MAPK、AP-1等多條下游通路,降低多種炎癥因子表達(dá)[4-6]。本研究所采用的EIU模型中,LPS誘導(dǎo)急性內(nèi)毒素性葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制主要是LPS經(jīng)血液循環(huán),作用于葡萄膜固有組織巨噬細(xì)胞表面TLR4,激活巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子,并進(jìn)一步上調(diào)其他炎癥因子如IL-6的表達(dá),IL-6進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等[13];同時(shí)LPS誘導(dǎo)的感染應(yīng)激狀態(tài)下ROS大量產(chǎn)生,進(jìn)而激活NF-κB,升高下游炎癥介質(zhì)的表達(dá)[6,14]。因此,SCM-198針對(duì)性下調(diào)上述通路的激活,進(jìn)而下調(diào)對(duì)應(yīng)炎癥因子表達(dá),這種變化在本研究中也得到了形態(tài)學(xué)變化的佐證,因此SCM-198在EIU模型中的抗炎作用是明確的。然而,人類葡萄膜炎病理生理機(jī)制仍待明確,遠(yuǎn)比EIU模型復(fù)雜。已證實(shí)的包括BAB和BRB破壞導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、多種炎癥介質(zhì)過(guò)表達(dá),周圍炎癥細(xì)胞暴露于細(xì)胞因子和趨化因子環(huán)境中引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),及ROS激活導(dǎo)致的多條下游信號(hào)通路激活產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。因此SCM-198在臨床工作中的價(jià)值有待深入研究。

本研究采用的模型是LPS介導(dǎo)的急性全葡萄膜炎。既往文獻(xiàn)報(bào)道,大鼠造模后4 h內(nèi)出現(xiàn)虹膜血管擴(kuò)張、睫狀充血,6 h出現(xiàn)前房閃輝、細(xì)胞和纖維素滲出、18～24 h炎癥反應(yīng)達(dá)到最高峰[7,15],48 h左右炎癥反應(yīng)開(kāi)始緩解并在4～7天后完全消失[15]。炎癥因子中表達(dá)最先上升的是TNF-α和IL-1β,二者能夠上調(diào)IL-6的表達(dá),造模后24 h IL-6表達(dá)顯著升高;炎癥恢復(fù)期則表現(xiàn)為IL-10、IL-12、TGF-β等保護(hù)性因子表達(dá)上升[13,16]。本研究取樣的時(shí)點(diǎn)是造模后24 h的炎癥反應(yīng)最高峰。因此裂隙燈下和組織病理學(xué)形態(tài)均觀察到明顯變化。由于TNF-α和IL-1β是最先出現(xiàn)的炎癥因子,故其表達(dá)變化和SCM-198對(duì)其產(chǎn)生的抑制作用最為明顯,甚至表達(dá)低于陽(yáng)性對(duì)照組;IL-6出現(xiàn)晚于兩者,故雖觀察到SCM-198的和DEX對(duì)其表達(dá)的抑制作用,但各組間差距不如前兩者明顯。

眼科炎癥相關(guān)性疾病一直以來(lái)是治療難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。近年來(lái)傳統(tǒng)藥物單體、單克隆抗體研發(fā)成為熱點(diǎn)研究方向。日本學(xué)者報(bào)道茜草素在EIU模型抗炎中取得良好效果[19-20],其作用機(jī)制也與減輕氧化應(yīng)激損傷及后續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān),與本研究異曲同工。多個(gè)TNF-α單克隆抗體治療HLA-B27相關(guān)性葡萄膜炎的臨床試驗(yàn)也取得成效[21]。此類藥物與傳統(tǒng)抗炎藥物作用機(jī)制不同,靶向更精準(zhǔn),因而不良反應(yīng)更輕微、可控,未來(lái)發(fā)展前景廣闊。本研究中選取的SCM-198已是應(yīng)用于臨床的成熟藥物,未來(lái)如能應(yīng)用于眼科領(lǐng)域,將為此類疾病治療作出貢獻(xiàn)。

下一步研究中,我們將致力于對(duì)SCM-198應(yīng)用于眼部抗炎的最佳給藥方式、給藥劑量給出更深入的回答。總之,SCM-198灌胃給藥對(duì)EIU模型大鼠具有保護(hù)作用,SCM-198作為潛在的眼科抗炎藥物,值得進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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