食管鱗狀細胞癌中ARTN、GFRα3的表達及臨床意義

陳雅琪，蹇順海， 黃一凡，文 彬

(川北醫(yī)學(xué)院， 四川 南充 637000)

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)我國最新流行病學(xué)調(diào)查報告，其發(fā)病率、死亡率均居癌癥的第3位，且呈上升趨勢[1]。食管癌早期癥狀不明顯，5年生存率僅為15%～25%[2]。目前，尚無能協(xié)助食管癌早期診斷及評估隨訪患者預(yù)后的有效的生物標志物。此外,傳統(tǒng)的臨床病理參數(shù)包括腫瘤組織學(xué)分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，不能全面有效地評估患者預(yù)后，因此尋找新的生物學(xué)指標尤為重要。

ARTN是膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，與其受體GFRα1、 GFRα3結(jié)合，再激活下游的絡(luò)氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase，RET)向細胞內(nèi)傳遞信號，但ARTN與GFRα3受體的作用更強，能在多種惡性腫瘤中表達，具有促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及新生血管的形成等作用[3]。目前尚無聯(lián)合檢測ARTN與GFRα3在食管癌中的表達及與食管癌的臨床病理參數(shù)關(guān)系的方法，因此本實驗檢測膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子ARTN及受體GFRα3在食管鱗癌中的表達及其生物學(xué)作用，探討其與食管鱗狀細胞癌的發(fā)展及預(yù)后關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2009年1月1日—2010年12月30日存檔確診的食管鱗狀細胞癌石蠟標本114例，標本均重新閱片，患者年齡為39～82歲，平均(57.2±4.23)歲。另選取高級別上皮內(nèi)瘤變標本17例，年齡為42～75歲，平均(59.6±6.37)歲。選取正常食管組織25例(以正常食管切緣代替)作為對照組。所有標本術(shù)前均未經(jīng)放、化療，術(shù)前簽署相關(guān)知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 方法

標本均按正常程序取材、固定、制片。ARTN兔抗人單克隆抗體(1∶50)購自Abcam公司。GFRα3兔抗人多克隆抗體購自Atlas公司(HPA020731， 1∶600)。即用型檢測試劑、即用型過氧化物酶及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司，兩者以胰腺癌標本做陽性對照，組織本身做陰性內(nèi)對照。采用免疫組化SP兩步法檢測ARTN、GFRα3蛋白的表達。

1.3 結(jié)果判定

ARTN、GFRα3陽性信號定位于癌細胞膜或細胞質(zhì)，以陽性染色范圍及著色強度共同判定。陽性染色范圍以陽性細胞所占百分比劃分：無細胞著色判為0分；著色范圍小于25%為1分；著色范圍25%～50%為2分；著色范圍50%～75%為3分；著色范圍大于75%為4分。著色強度無色為0分；著色淺黃色為1分；著色棕黃色為2分；著色棕褐色為3分。最后由副高以上級別病理醫(yī)師判定，求兩者分數(shù)之和。小于等于2分為陰性(-)，3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析組間比較采用卡方檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05判定為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件分析完成。

2 結(jié)果

2.1 ARTN、GFRα3在食管組織中的表達

ARTN和GFRα3表達于細胞質(zhì)或細胞膜，可見強陽性、中等陽性、弱陽性及陰性表達，結(jié)果以陽性及陰性例數(shù)計。ARTN在食管正常組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織、食管鱗狀細胞癌組織中的陽性率分別為0(0/25)、23.5% (4/17)、80.7% (92/114)，陽性表達率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05)。同樣，GFRα3在3種組織中的陽性率分別為0(0/25)、29.4%(5/17)、76.3%(87/114)，GFRα3的陽性表達率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05)。具體情況見圖1、2和表1。

圖1 ARTN 在食管組織中的表達(SP兩步法)

圖2 GFRα3在食管鱗狀細胞癌中表達(SP兩步法)

2.2 ARTN、GFRα3表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關(guān)系

ARTN、GFRα3兩者在食管鱗癌中的表達與腫瘤浸潤深度及TNM分期相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤部位及分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表1 不同食管組織中ARTN, GFRα3的表達

注：N為正常食管切緣組織；H代表高級別上皮內(nèi)瘤變組織；ESCC為食管鱗狀細胞癌組織。

表2 ARTN、GFRα3蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表(表2)

2.3 ARTN、GFRα3在食管鱗癌組織中表達的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示， GFRα3表達水平伴隨ARTN表達的增高而增高，二者呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.198，P<0.05)，見表3。

表3 食管鱗狀細胞癌中ARTN蛋白和GFRα3蛋白表達之間的關(guān)系

3 討論

膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子ARTN、GFRα3可在多種惡性腫瘤中表達，促進腫瘤生長、浸潤等，發(fā)揮致瘤作用，但在各種惡性腫瘤中的作用不盡相同。ARTN在女性生殖系統(tǒng)中子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌中表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤深度及轉(zhuǎn)移有關(guān)，并能影響癌細胞對藥物的反應(yīng)[3-5]。ARTN表達與肝細胞肝癌腫塊大小、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)[6]。胰腺癌中，ARTN的表達促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、周圍神經(jīng)浸潤，并與神經(jīng)浸潤的范圍和密度相關(guān)[7]。Gao等[8]發(fā)現(xiàn)：ARTN及受體GFRα1在喉組織中表達，喉鱗癌中表達高于喉息肉組織并與喉鱗癌TNM分期及預(yù)后相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，兩者表達具有相關(guān)性，共同作用促進腫瘤的進展。另外，LI等[9]研究了ARTN與食管癌的關(guān)系，指出ARTN在食管鱗癌組織及培養(yǎng)的癌細胞中表達，在癌組織中的表達高于正常組織，但未研究其與食管鱗癌的臨床病理之間的關(guān)系。

本研究采用免疫組化法檢測正常食管組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織，食管鱗癌組織中ARTN、GFRα3蛋白的表達，結(jié)果顯示：ARTN在正常食管組織、高級別上皮內(nèi)瘤變組織、食管鱗癌組織中的陽性表達率分別為0、23.5%、80.7%；GFRα3的陽性表達率分別為0、29.4%、76.3%，表達水平逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果證實ARTN可能有促進食管鱗癌生長的作用。

患者自身不可抗因素(如年齡)及腫瘤的臨床病理特點是影響患者預(yù)后的重要因素，本次實驗研究結(jié)果表明：ARTN、GFRα3表達與食管鱗癌浸潤深度、腫瘤分期密切相關(guān)，即浸潤越深，腫瘤分期越高，ARTN、GFRα3蛋白表達越高，表明ARTN、GFRα3可能對促進腫瘤的浸潤有重要作用，即一方面通過降解細胞外基質(zhì)，破壞基膜的完整性，引導(dǎo)癌細胞遷移，從而促進腫瘤生長、浸潤[10]，另一方面ARTN可與多種蛋白酶及生長因子反應(yīng)，促進腫瘤的血管生成，從而增強腫瘤侵襲能力[11]。ARTN、GFRα3與患者年齡、性別、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

ARTN屬膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial derived nuerotrofic factor family,GDNF)家族成員之一，其他家族成員包含GDNF、PSPN及NRTN，與相應(yīng)的配體結(jié)合(GFRα1-4)再與RET結(jié)合形成復(fù)合體并通過多條路徑才能在胞內(nèi)傳遞信號，發(fā)揮生物學(xué)作用，其中ARTN能與GFRα1、GFRα3兩種受體結(jié)合，但與GFRα3結(jié)合能力更強[12]。本次實驗研究結(jié)果表明：ARTN、GFRα3在食管鱗癌中表達具有相關(guān)性，兩者呈正相關(guān)(P<0.05)， GFRα3表達隨ARTN表達升高而升高，兩者共同作用激活下游信號通路，發(fā)揮致瘤作用。

綜上所述，ARTN、GFRα3與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，兩者可能促進食管鱗癌的惡性程度及進展。 聯(lián)合檢測ARTN和GFRα3的表達對預(yù)測食管鱗癌的發(fā)生、浸潤及判斷臨床分期有一定參考價值。

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