紫穗槐叢枝菌根(AM)根系分泌物誘導(dǎo)根瘤菌結(jié)瘤因子及作用研究

莊 倩，趙曉娟，宋福強(qiáng)*

(1.黑龍江省森林植物園，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江大學(xué) 生命學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

叢枝菌根真菌(Glomusmosseae)是一類土著真菌，在自然界中分布廣泛且歷史悠久。該類真菌能夠與大部分高等植物根系建立共生關(guān)系并形成叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)[1]。植物形成AM后能夠促進(jìn)根系對(duì)養(yǎng)分的吸收[2]，提高植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力[3-6]，對(duì)重金屬及有機(jī)農(nóng)藥污染的土壤也具有較好的修復(fù)能力[7]，從而改善植物的生長(zhǎng)境況。結(jié)瘤因子(脂殼寡糖，LCOs)被定義為根瘤菌在豆科植物根系分泌物(類黃酮)作用下分泌合成的一類多糖類物質(zhì)[8]，這類物質(zhì)能夠引起宿主植物根系在形態(tài)上發(fā)生巨大變化，在根系結(jié)瘤過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用[9]。LCO不但可以促進(jìn)豆科植物根系結(jié)瘤固氮，而且對(duì)某些非豆科類植物根系細(xì)胞分裂等也同樣具有一定的刺激作用[10]。

紫穗槐(Amorphafruticosa)在世界范圍內(nèi)廣泛分布，屬于木本豆科、紫穗槐屬，是一種耐鹽堿、耐寒、耐旱、耐濕、抗風(fēng)沙、抗逆性極強(qiáng)的多年生落葉叢生灌木，在荒山坡地、道路旁、河岸、鹽堿地均可生長(zhǎng)；同時(shí)，紫穗槐具有很高的經(jīng)濟(jì)效益，其莖條萌發(fā)力極強(qiáng)，是優(yōu)良的飼料植物[11]。紫穗槐不但能形成根瘤，同時(shí)還能夠叢枝菌根。前期研究結(jié)果表明AM真菌能夠顯著提高紫穗槐結(jié)瘤數(shù)量并提高其固氮能力[12]。本研究繼續(xù)開(kāi)展AM真菌與紫穗槐共生體根系分泌物對(duì)根瘤菌結(jié)瘤因子的誘導(dǎo)情況，以及結(jié)瘤因子對(duì)紫穗槐的菌根形成、生長(zhǎng)情況的影響，研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示AM真菌促進(jìn)紫穗槐結(jié)瘤數(shù)量固氮能力的機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株為紫穗槐種子，根瘤菌菌株為紫穗槐中慢生根瘤菌(Mesorhizbiumamorphae)，AM真菌為摩西球囊霉(Glomusmosseae)。

1.2 方法

1.2.1 盆栽苗木設(shè)計(jì) 選擇飽滿的紫穗槐種子，用溫水搓洗2～3次，再用KMnO4(濃度0.3%)浸泡3～4 h，用清水沖洗干凈。在恒溫水浴鍋(25℃)中清水浸種1 d。然后淘洗2～3次，催芽。苗木盆栽培養(yǎng)基質(zhì)按花土(5)∶蛭石(3)∶細(xì)沙(2)比例混勻，高壓滅菌1 h后，在陰涼處干燥、備用。

盆栽苗木設(shè)2個(gè)處理：1)單獨(dú)接種AM真菌處理(AM)：當(dāng)紫穗槐種子播種15 d時(shí)施入AM真菌接種物，接種量為盆栽介質(zhì)體積的5%；2)非接種處理(CK)：紫穗槐種子播種15 d時(shí)加入與單接種AM處理等量的滅活A(yù)M真菌接種物及其濾出液。每種處理設(shè)10個(gè)重復(fù)。

1.2.2 侵染率的測(cè)定 采用J.M.Phillip[13]等的KOH脫色-酸性品紅染色法，玻片鏡檢測(cè)定侵染根段數(shù)。

1.2.3 根系分泌物的提取 根據(jù)紫穗槐侵染率的實(shí)時(shí)測(cè)定結(jié)果，選取紫穗槐出苗15 d(菌根侵染率0%)和菌根侵染率為15%、25%、50%及100%時(shí)期根系表面土壤各100 g，樣品分裝在三角瓶中并加入濃度為80%的乙醇500 mL，在90℃水浴下持續(xù)加熱3 h后，采用濾紙抽濾，再用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀控制溫度在40℃的條件下對(duì)獲得濾液進(jìn)行蒸發(fā)，直至10 mL為止，然后放到冰箱中保存。同時(shí)提取相應(yīng)時(shí)期CK處理苗木的根系分泌物為對(duì)照。

1.2.4 結(jié)瘤因子的提取與制備 首先配制一定量的YMA液體培養(yǎng)基，121℃下高壓滅菌30 min，冷卻后接種適量根瘤菌。28℃、160 r·min-1搖床上培養(yǎng)至OD值0.6～0.8，制成種子液。在三角瓶中裝入300 mL YMA液體培養(yǎng)基，同時(shí)接入種子液2.5 mL，在28℃ 160 r·min-1搖床上培養(yǎng)2 d，再向搖瓶中分別加入5 mL前期提取的菌根分泌物和對(duì)照處理根系分泌物，以此作為根瘤菌結(jié)瘤因子的誘導(dǎo)劑，繼續(xù)搖培至OD值1～1.2。以不加誘導(dǎo)劑作為對(duì)照。用正丁醇對(duì)所獲得的液體培養(yǎng)基以3∶2比例進(jìn)行抽提2次，得到的上清液再利用孔徑為0.45 μm的濾膜抽濾后，再蒸發(fā)至1 mL，然后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，利用 4℃離心機(jī)12 000 r·min-1下離心5 min，得到的上清液低溫保存過(guò)夜，次日再離心3 min，獲得的上清液保存在乙腈中備用。

1.2.5 HPLC檢測(cè)結(jié)瘤因子 對(duì)檢測(cè)樣品過(guò)C18柱(φ4.6 mm×250 mm)，然后進(jìn)行線性梯度洗脫，對(duì)洗脫物進(jìn)行結(jié)瘤因子分析。HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫25℃，洗脫時(shí)間1 h。

1.2.6 結(jié)瘤因子的生物檢測(cè) 采用根毛變形試驗(yàn)方法對(duì)結(jié)瘤因子的生物活性進(jìn)行檢測(cè)[14]。首先配制瓊脂含量為1.5%的溶液，121℃高壓滅菌15 min后倒平板、備用。紫穗槐種子用濃度1% 的NaOH溶液反復(fù)淘洗，直至去除種子表皮上的蠟質(zhì)，隨后再用溫水反復(fù)沖洗后，放到2%的NaOCl溶液浸泡2 min，再用滅菌蒸餾水再?zèng)_洗干凈。處理后的種子放到先前準(zhǔn)備好的水瓊脂平板內(nèi)，每個(gè)平板放10粒種子，25℃恒溫避光培養(yǎng)，種子發(fā)芽以后仍要繼續(xù)培養(yǎng)15 d以上。用滅菌的解剖刀將嫩根部切下放到載玻片上，并滴加1滴結(jié)瘤因子檢測(cè)液，黑暗條件下25℃培養(yǎng)24 h。隨后將載玻片置于顯微鏡下，滴加甲基藍(lán)染液進(jìn)行染色，觀察根系的變化。

1.2.7 結(jié)瘤因子回接紫穗槐 取結(jié)瘤因子10 mL，在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，然后加1 mL蒸餾水溶解并梯度稀釋。結(jié)瘤因子回接試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理：1)單接種AM真菌處理(AM+)：按照盆栽培養(yǎng)基質(zhì)5%(v/v)的量向基質(zhì)中接種摩西球囊霉接種物，同時(shí)播種預(yù)先處理好的紫穗槐的種子；2)單接種結(jié)瘤因子(Nod1+)：盆栽苗木只加入結(jié)瘤因子稀釋液10 mL；3)單接種結(jié)瘤因子(Nod2+)：盆栽苗木只加入結(jié)瘤因子稀釋液20 m；4)雙接AM真菌和結(jié)瘤因子(AM+Nod1+)：對(duì)盆栽紫穗槐加入AM真菌接種物并加入結(jié)瘤因子稀釋液10 mL；5)雙接AM真菌和結(jié)瘤因子(AM+Nod2+)：對(duì)盆栽紫穗槐加入AM真菌接種物并加入結(jié)瘤因子稀釋液20 mL；6)非接種處理(CK)：播種紫穗槐種子的同時(shí)加入與單接種AM真菌處理等量滅活的AM真菌接種物及其濾出液。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

不同處理的盆栽紫穗槐隨機(jī)擺放在溫室內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)苗子生長(zhǎng)到第10周時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)選取紫穗槐苗木10株，分別測(cè)定苗木菌根侵染率、植株各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)，以及每株紫穗槐苗木根系上根瘤原基的數(shù)量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物對(duì)根瘤菌結(jié)瘤因子誘導(dǎo)

通過(guò)HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，不同處理樣品圖譜的各時(shí)間段誘導(dǎo)的結(jié)瘤因子出峰時(shí)間不盡相同，且同一時(shí)間段AM處理與CK處理的出峰時(shí)間也有所差異，出峰數(shù)量也各不相同。

表1 不同處理紫穗槐在不同時(shí)期根系分泌物對(duì)根瘤菌結(jié)瘤因子誘導(dǎo)HPLC分析出峰數(shù)量Table 1 The peak number of HPLC related to rhizobia nod factor induced by different periods of Amorpha fruticosa root exudates in different treatments

從表1可以看出，AM處理組誘導(dǎo)的根瘤菌結(jié)瘤因子相較空白對(duì)照組來(lái)說(shuō)在侵染率0%與10%時(shí)期產(chǎn)生的峰值數(shù)量基本相同，但在菌根侵染率在25%時(shí)期特異峰最多，產(chǎn)生的差異峰達(dá)到24種之多。

對(duì)菌根侵染率在25%時(shí)期AM處理與對(duì)照處理可能為結(jié)瘤因子且明顯的差異峰進(jìn)行結(jié)瘤因子生物檢測(cè)(根毛變形試驗(yàn))，結(jié)果表明，在33 min出現(xiàn)的色譜峰能夠誘導(dǎo)紫穗槐的根毛產(chǎn)生變形，根毛頂端膨大(圖1c)，且呈 “Z”字形彎曲(圖1d)，可以認(rèn)為33 min左右出現(xiàn)的峰為結(jié)瘤因子。

注：a、b為對(duì)照；c、d為產(chǎn)生變形的根毛(400×)

由于HPLC檢測(cè)的物質(zhì)量與峰面積呈正比，因此對(duì)33 min出現(xiàn)的色譜峰進(jìn)行面積測(cè)定。由表2可知，紫穗槐苗木形成菌根的不同時(shí)期，菌根根系分泌物對(duì)根瘤菌結(jié)瘤因子的誘導(dǎo)量都顯著高于對(duì)照處理。苗木在生長(zhǎng)不同時(shí)期根系分泌物誘導(dǎo)根瘤菌產(chǎn)生結(jié)瘤因子的峰面積也有所不同，在菌根侵染率25%與100%時(shí)期，無(wú)論是AM處理還是CK處理之間不存在顯著差異(P>0.05)，但都顯著高于菌根侵染率0%和10%時(shí)期(P<0.05)。

2.2 結(jié)瘤因子回接紫穗槐苗木的效果

當(dāng)苗子生長(zhǎng)到第10周時(shí)，分別測(cè)定了不同處理紫穗槐苗木的菌根侵染率、株高、鮮重以及根瘤原基的數(shù)量。從表3可以看出，AM真菌與結(jié)瘤因子混合處理的紫穗槐苗木菌根侵染率顯著高于單接種AM真菌處理，且隨著結(jié)瘤因子濃度的增加，效果越顯著。在沒(méi)有接種AM真菌處理的苗木根系內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到菌根侵染率，表明苗木培養(yǎng)基質(zhì)滅菌比較測(cè)底，沒(méi)有土著AM真菌存在。AM+Nod2+處理的苗木菌根侵染率、株高、鮮重及根瘤原基數(shù)量都顯著高于其他處理(P<0.05)，而CK處理最差。單接種結(jié)瘤因子與對(duì)照相比提高了根瘤原基的數(shù)量并促進(jìn)了苗木的生長(zhǎng)，且Nod2+優(yōu)于Nod1+。單接種AM真菌也同樣促進(jìn)了苗木的生長(zhǎng)，但效果顯著低于雙接種(AM+Nod+)處理(P<0.05)。

表2 不同處理根系分泌物誘導(dǎo)根瘤菌產(chǎn)生結(jié)瘤因子的峰面積Table 2 The peak area of rhizobia nodulation factors induced by root exudates in different treatments

注：表中數(shù)據(jù)為平均值(n=3)；不同大寫(xiě)字母表示同行數(shù)據(jù)存在顯著差異，不同小寫(xiě)字母表示同列數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05)。

表3 結(jié)瘤因子回接對(duì)紫穗槐苗木的影響結(jié)果Table 3 The effect of nodulation factor inoculation on A.fruticosa seedlings

注：表中數(shù)據(jù)為平均值(n=10)；不同小寫(xiě)字母表示同列數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

AM真菌能夠與紫穗槐根系形成菌根共生體，侵染率可達(dá)100%；紫穗槐菌根侵染率在25%時(shí)的根系分泌物能夠有效地誘導(dǎo)根瘤菌產(chǎn)生更多的結(jié)瘤因子；紫穗槐菌根分泌物對(duì)根瘤菌誘導(dǎo)出的結(jié)瘤因子能夠使紫穗槐根毛頂端膨大形成根瘤原基；結(jié)瘤因子與AM真菌混合接種能顯著提高紫穗槐苗木的菌根侵染率、株高、鮮重和根瘤原基的數(shù)量，且隨著結(jié)瘤因子含量的增加效果越顯著。

結(jié)瘤因子是在宿主植物根系分泌的類黃酮作用下，根瘤菌合成并分泌一類多糖信號(hào)分子(脂殼寡糖)。不同根瘤菌能形成2～60種的結(jié)瘤因子[15]。結(jié)瘤因子的質(zhì)與量隨著根瘤菌種類的不同而發(fā)生改變并具有種屬專一性。結(jié)瘤因子的合成決定于結(jié)瘤基因nod的表達(dá)，nod基因種類多樣，其產(chǎn)物可以合成結(jié)瘤因子[16]。nod基因的表達(dá)起始于根瘤菌感知類黃酮類物質(zhì)[17]。類黃酮類物質(zhì)能夠誘導(dǎo)根瘤菌nodD調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，隨后啟動(dòng)nodABC的表達(dá)。類黃酮與NodD調(diào)節(jié)蛋白的早期接觸會(huì)激活nod基因的轉(zhuǎn)錄從而合成結(jié)瘤因子以產(chǎn)生根瘤原基。AM真菌在與植物形成共生體-菌根時(shí)，高等植物分泌的類黃酮物質(zhì)被公認(rèn)為共生體形成和發(fā)展的初始信號(hào)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)紫穗槐菌根侵染率在25%時(shí)期的根系分泌物能夠有效誘導(dǎo)根瘤菌產(chǎn)生更多的結(jié)瘤因子，但是否與此時(shí)紫穗槐分泌更多的類黃酮物質(zhì)有關(guān)，還有待于進(jìn)一步研究。

結(jié)瘤因子能夠使根瘤菌進(jìn)入根部以及皮層細(xì)胞，并誘導(dǎo)結(jié)瘤基因的表達(dá)以及細(xì)胞分化，引起根瘤原基的形成[19]。結(jié)瘤因子還被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)種子萌發(fā)、植物地上部分的生長(zhǎng)[20]以及側(cè)根的伸長(zhǎng)[21]。C.Chen[22]等發(fā)現(xiàn)Bradyhizobiumjaponicum的結(jié)瘤因子能夠加速西紅柿的開(kāi)花結(jié)果，并且能夠提高西紅柿的產(chǎn)量，同時(shí)結(jié)瘤因子還能夠提升干旱條件下大豆植株的產(chǎn)量等[23]。本研究進(jìn)一步證明了AM真菌與結(jié)瘤因子混合接種能夠顯著提高紫穗槐的生物量和根瘤原基的數(shù)量。研究結(jié)果對(duì)揭示AM真菌在生態(tài)系統(tǒng)中的作用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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