利用蟹殼制備乳酸鈣和甲殼素的技術(shù)研究

韓曉梅，王晨笑，楊鑫，王博，桑亞新，孫紀(jì)錄，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102209；3.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京102209）

隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)螃蟹產(chǎn)量逐年遞增，在加工或食用過(guò)程中產(chǎn)生大量的蟹殼。長(zhǎng)期以來(lái)，蟹殼除少量被低值化利用之外，多是作為垃圾扔掉，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。實(shí)際上，蟹殼中含有豐富的化學(xué)物質(zhì)，其中包括蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和甲殼素，礦物質(zhì)含量約占50%，甲殼素含量約為15%～25%。

甲殼素（chitin）又稱幾丁質(zhì)，廣泛存在于甲殼類海洋節(jié)肢動(dòng)物中[1]。甲殼素是一種高分子的糖化合物，吸濕性強(qiáng)，能夠吸附重金屬離子，無(wú)毒無(wú)味，可以作為食品填充劑、穩(wěn)定劑、脫色劑等，已在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、輕紡、環(huán)保等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2-4]。在工業(yè)上從蟹殼中提取甲殼素，主要過(guò)程為在機(jī)械攪拌下用鹽酸對(duì)蟹殼脫鈣，用堿脫蛋白質(zhì)[5]，目前，甲殼素及其衍生物的制備廣受關(guān)注[6-9]，如王金香等以華溪蟹蟹殼為原料，采用稀鹽酸脫鈣和稀堿脫蛋白，甲殼素收率為13%[10]。在本文中用堿性電解水（basic electrolyzed water，BEW）代替?zhèn)鹘y(tǒng)的堿處理脫蛋白，BEW通過(guò)電解稀鹽（通常是NaCl）溶液從陰極產(chǎn)生，其pH值可達(dá)12左右，氧化還原電位約為-80 mV。關(guān)于BEW的應(yīng)用，已有諸多研究報(bào)道[11]，如BEW可以作為去污劑等。BEW和傳統(tǒng)堿液脫蛋白工藝中使用的NaOH溶液在酸堿性方面具有極高的相似性，且電解水對(duì)人體健康和環(huán)境無(wú)害，安全性好，可現(xiàn)場(chǎng)生產(chǎn)，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉[12]。因此研究BEW處理蟹殼對(duì)開(kāi)發(fā)一種新型的綠色環(huán)保的蟹殼脫蛋白技術(shù)工藝具有一定現(xiàn)實(shí)意義。

除此之外，蟹殼中的礦物質(zhì)含量高達(dá)50%，主要以碳酸鈣的形式存在，是一種天然的綠色鈣源。然而，碳酸鈣不易被人體吸收利用，而乳酸鈣以其高溶解度、高吸收率和高安全性等優(yōu)點(diǎn)成為補(bǔ)鈣劑的優(yōu)選[13]，可以作為一種營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑[14]、穩(wěn)定劑及增稠劑[15]等，還可以用作面包發(fā)酵粉的膨松劑和緩沖劑。本研究擬利用乳酸，采用直接中和的方法將蝦蟹殼中的碳酸鈣轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗徕}[16-17]，使其廣泛應(yīng)用于工業(yè)、食品及醫(yī)療行業(yè)等，并結(jié)合堿性電解水相繼處理脫蛋白質(zhì)提取甲殼素，從而為綜合利用蟹殼資源提供一條高效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟹殼：河北省黃驊市產(chǎn)梭子蟹；其他試劑：均為分析純。

電解水發(fā)生器：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制；PHS-3DW型pH計(jì)：安徽合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；3K15型低溫冷凍離心機(jī)：SIGMA；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；XL-100型馬弗爐：河南市鶴壁億欣儀器儀表有限公司；JJ-1型電動(dòng)攪拌器：常州國(guó)宇儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟹殼粉的制備

蟹殼清洗，然后放入50℃電熱鼓風(fēng)干燥器中干燥12 h，將烘干的蟹殼粉碎，過(guò)篩，制備120目蟹殼粉末備用。

1.2.2 乳酸鈣的制備

稱取10 g蟹殼粉置于250 mL錐形瓶中，緩慢加入一定量的乳酸與其發(fā)生中和反應(yīng)。為了防止發(fā)生溢液現(xiàn)象，需邊加乳酸邊攪拌。利用恒溫水浴搖床控制反應(yīng)溫度，當(dāng)不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，則表明反應(yīng)完全。待反應(yīng)完全后，將反應(yīng)溶液加熱升溫至70℃，溶解產(chǎn)生的乳酸鈣，趁熱抽濾得到乳酸鈣母液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于65℃下加熱濃縮，收集濃縮液并冷卻靜置結(jié)晶24 h。分離晶體與母液，由于乳酸鈣在水中的溶解度比較大，結(jié)晶后母液中仍留有大量的乳酸鈣，需要濃縮后再次結(jié)晶，合并晶體。加入適量無(wú)水乙醇，洗滌反應(yīng)生成的乳酸鈣晶體，除去未反應(yīng)的乳酸及表面附著的其他殘留物。將無(wú)水乙醇洗后的乳酸鈣置于電熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行低溫靜態(tài)干燥，干燥溫度為80℃，干燥時(shí)間8 h，將樣品粉碎、過(guò)篩、包裝得到白色粉末狀乳酸鈣成品。

1.2.3 乳酸鈣制備條件優(yōu)化

遵循單一因素變量的原則，研究蟹殼粉粒徑大小、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比、乳酸稀釋倍數(shù)對(duì)乳酸鈣產(chǎn)率的影響，從而設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，確定實(shí)現(xiàn)產(chǎn)率最大化的最佳反應(yīng)條件。

1.2.3.1 蟹殼粉粒徑大小的確定

固定條件：蟹殼粉使用量為10 g，反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h，料液比為1∶10（g/mL），乳酸稀釋倍數(shù)為9倍。蟹殼粉粒徑大小分為3個(gè)水平：80、120、160目。待反應(yīng)完全后，經(jīng)濃縮，洗滌，干燥即得產(chǎn)品，分別測(cè)定乳酸鈣產(chǎn)率。

1.2.3.2 乳酸稀釋倍數(shù)的確定

固定條件：蟹殼粉使用量為10 g，蟹殼粒徑大小為120目，反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h，料液比為1 ∶10（g/mL）。乳酸稀釋倍數(shù)分為4 個(gè)水平：4、9、14、19倍。待反應(yīng)完全后，經(jīng)濃縮，洗滌，干燥即得產(chǎn)品，分別測(cè)定乳酸鈣產(chǎn)率。

1.2.3.3 料液比的確定

固定條件：蟹殼粉使用量為10 g，蟹殼粒徑大小為120目，反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h，乳酸稀釋倍數(shù)為9倍。料液比分為4個(gè)水平：1∶6、1∶8、1∶10、1 ∶12（g/mL）。待反應(yīng)完全后，經(jīng)濃縮，洗滌，干燥即得產(chǎn)品，分別測(cè)定乳酸鈣產(chǎn)率。

1.2.3.4 中和反應(yīng)溫度的確定

固定條件：蟹殼粉使用量為10 g，蟹殼粒徑大小為120 目，反應(yīng)時(shí)間為1 h，料液比為1 ∶10（g/mL），乳酸稀釋倍數(shù)為9倍。中和反應(yīng)溫度分為4個(gè)水平：25、40、55、70℃。待反應(yīng)完全后，經(jīng)濃縮，洗滌，干燥即得產(chǎn)品，分別測(cè)定乳酸鈣產(chǎn)率。

1.2.3.5 中和反應(yīng)時(shí)間的確定

固定條件：蟹殼粉使用量為10 g，蟹殼粒徑大小為120目，反應(yīng)溫度為25℃，料液比為1∶10（g/mL），乳酸稀釋倍數(shù)為9倍。中和反應(yīng)時(shí)間分為4個(gè)水平：1.0、1.5、2.0、2.5 h。待反應(yīng)完全后，經(jīng)濃縮，洗滌，干燥即得產(chǎn)品，分別測(cè)定乳酸鈣產(chǎn)率。

1.2.4 乳酸鈣產(chǎn)品的理化指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)于使用乳酸處理蟹殼粉制得的乳酸鈣產(chǎn)品，依據(jù)GB 1886.21-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑乳酸鈣》，分別測(cè)定其乳酸鈣含量、加熱減量及砷、鉛、鎂的含量。

1.2.5 堿性電解水后繼處理蟹殼粉脫蛋白質(zhì)提取甲殼素

蟹殼粉經(jīng)乳酸處理脫礦物質(zhì)后剩余的殘?jiān)?jīng)過(guò)濾、干燥后備用。取10 g殘?jiān)湃雺A性電解槽中，加入不同濃度NaCl（1%和0.1%）水溶液1 L，靜置10min測(cè)定初始pH值。接通電源電解，將電壓設(shè)定為20 V，隨著堿性電解水產(chǎn)生，其對(duì)蟹殼粉脫蛋白質(zhì)作用也同步進(jìn)行。連續(xù)處理期間，不間斷攪拌，并按照一定時(shí)間間隔測(cè)定電解液pH值，6 h后停止電解，抽濾除去電解液，然后，將蟹殼粉殘?jiān)礈熘林行裕? 000 r/min離心10min，于60℃干燥8 h，稱重測(cè)定樣品的收率、灰分含量及蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 NaOH后繼脫蛋白從蟹殼中提取甲殼素

蟹殼粉經(jīng)乳酸處理脫礦物質(zhì)后的殘?jiān)?jīng)過(guò)濾、干燥后備用。取10 g殘?jiān)?，加入一定量? mol/LNaOH溶液，于70℃下反應(yīng)4 h，以除去所有蛋白質(zhì)。過(guò)濾，將蟹殼粉殘?jiān)礈熘林行裕? 000 r/min離心10min，于60℃下干燥8 h，即得甲殼素粗品。

以乳酸和NaOH聯(lián)合處理提取的甲殼素做參照，計(jì)算經(jīng)乳酸和堿性電解水聯(lián)合處理蟹殼后蛋白質(zhì)的含量及脫除率。

1.2.7 灰分含量測(cè)定方法

參照國(guó)標(biāo)GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》的方法，測(cè)定甲殼素產(chǎn)品的灰分含量。

1.2.8 蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)脫除率測(cè)定方法

蛋白質(zhì)脫除率測(cè)定的原理：由于蟹殼中的甲殼素同樣含有氮元素，單純使用凱氏定氮法并不能準(zhǔn)確地計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量，因此，本研究利用凱氏定氮法測(cè)定堿性電解水處理后的樣品及傳統(tǒng)無(wú)機(jī)酸堿法提取的甲殼素中的含氮量，通過(guò)前者樣品中的氮含量減去后者甲殼素中的氮含量，即為蛋白質(zhì)中的氮含量，然后乘以蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)，即可計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)脫除率。

凱氏定氮法：稱取充分混勻的固體樣品0.1 g，精確至0.001 g，移入定氮瓶中，加入0.2 g硫酸銅，6 g硫酸鉀及10 mL濃硫酸，用消化爐消化3 h至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，取下冷卻，用凱氏定氮儀蒸餾滴定，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)含量ω及蛋白質(zhì)脫除率η，分別按式（1）、（2）計(jì)算：

式中：m1為堿性電解水處理蟹殼脫蛋白后殘?jiān)鼧悠返馁|(zhì)量，g；m2為傳統(tǒng)無(wú)機(jī)酸堿法處理蟹殼提取甲殼素的質(zhì)量，g；ω0為20 g蟹殼樣品中蛋白質(zhì)含量，%；ω1為堿性電解水處理蟹殼脫蛋白后殘?jiān)鼧悠返暮浚?；ω2為傳統(tǒng)無(wú)機(jī)酸堿法處理蟹殼提取甲殼素的含氮量，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鈣制備條件優(yōu)化

控制單一因素變量，研究蟹殼粒徑大小、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比、乳酸稀釋倍數(shù)對(duì)乳酸鈣產(chǎn)率的影響，從而確定實(shí)現(xiàn)產(chǎn)率最大化的最佳反應(yīng)條件，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳酸鈣制備的條件優(yōu)化Fig.1 Conditional optimization for preparation of calcium lactate

乳酸鈣提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，蟹殼粒徑的大小與中和反應(yīng)溫度對(duì)乳酸鈣提取的影響沒(méi)有明顯差異，選擇120目蟹殼在25℃下與乳酸中和提取乳酸鈣，隨著乳酸稀釋倍數(shù)的增加，乳酸濃度越低，提取的乳酸鈣產(chǎn)量越低，乳酸適宜的稀釋倍數(shù)為9倍稀釋，此時(shí)乳酸的濃度為1.14 mol/L，料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，乳酸鈣的產(chǎn)量明顯增加，繼續(xù)增加乳酸的量時(shí)則達(dá)到一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，由圖1中反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響從而確定中和反應(yīng)的時(shí)間為2 h。

綜合以上分析的結(jié)果，以蟹殼作為原料采用直接中和的方法制備乳酸鈣的最優(yōu)條件為：120目蟹殼粉20 g，9倍稀釋的乳酸（1.14 mol/L）以 1 ∶10（g/mL）的料液比于25℃下與蟹殼中的鈣鹽發(fā)生中和反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為2 h，經(jīng)過(guò)濃縮、結(jié)晶、洗滌、重結(jié)晶后，最終的得到的乳酸鈣的最高產(chǎn)量為0.89 g/g蟹殼粉。

2.2 乳酸鈣產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)

利用乳酸中和蟹殼中的鈣鹽從而實(shí)現(xiàn)脫礦物質(zhì)及制備乳酸鈣，對(duì)乳酸鈣的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 乳酸鈣各項(xiàng)產(chǎn)品指標(biāo)Table 1 The product indicators of the calcium lactate

表1結(jié)果表明，制備的乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到99.37%，加熱減量分?jǐn)?shù)為7.06%，鎂、鉛和砷含量均在國(guó)標(biāo)規(guī)定范圍內(nèi)，乳酸鈣的各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 堿性電解水后繼脫蛋白質(zhì)過(guò)程中pH值變化

分別用0.1%和1%的NaCl溶液制備堿性電解水，在堿性電解槽中加入一定量乳酸脫礦物質(zhì)后的蟹殼殘?jiān)?，連續(xù)電解，保持OH-的不斷產(chǎn)生，使得蟹殼粉中的蛋白質(zhì)得以持續(xù)脫除。定時(shí)測(cè)定電解過(guò)程（脫除過(guò)程）中的pH值變化，結(jié)果如圖2。

圖2 不同濃度NaCl制備的堿性電解水在連續(xù)處理蟹殼粉過(guò)程中的pH值變化Fig.2 The pH changes of BEW prepared with different concentrations of NaCl during the continuous treatment for crab shell powder

由圖2可見(jiàn)，在用堿性電解水處理蟹殼脫蛋白過(guò)程中，分別用1%和0.1%的NaCl溶液制備的堿性電解水，在相同的反應(yīng)時(shí)間下電解液的pH值均有所上升，且在第1個(gè)小時(shí)之內(nèi)上升最快并逐漸趨于穩(wěn)定，其中由1%NaCl制備的的堿性電解水在脫蛋白過(guò)程中pH值變化趨勢(shì)更顯著，從7.07上升到12.84，而由0.1%NaCl制備的堿性電解水在相同的脫蛋白時(shí)間下其pH值從7.08上升到12.18。從圖中可以明顯看出利用1%NaCl制備的堿性電解水能夠在較快的時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的堿度，并且在電解水電解過(guò)程中伴隨著產(chǎn)熱，有利于堿性電解水對(duì)蟹殼的脫蛋白質(zhì)作用。

2.4 堿性電解水后繼脫蛋白質(zhì)提取甲殼素

蟹殼經(jīng)過(guò)乳酸脫礦物質(zhì)后，取脫礦物質(zhì)后的樣品10 g，分別用1%NaCl和0.1%NaCl溶液制備的堿性電解水脫蛋白，并用NaOH處理作對(duì)照，研究乳酸和堿性電解水聯(lián)合處理提取甲殼素的效果，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 乳酸和堿性電解水聯(lián)合處理蟹殼提取的甲殼素常規(guī)指標(biāo)Table 2 Standard test results for chitin extracted by lactic acid and BEW treatment from crab shell powder

數(shù)據(jù)表明，用1%NaCl溶液制備的堿性電解水對(duì)乳酸脫礦物質(zhì)后的樣品進(jìn)行脫蛋白，蛋白質(zhì)含量由52%減少到7.53%，蛋白質(zhì)脫除率為90.54%，測(cè)得甲殼素的灰分含量為0.81%，表明用乳酸和堿性電解水聯(lián)合處理能較好的實(shí)現(xiàn)脫礦物質(zhì)和脫蛋白提取甲殼素，并且，高濃度的NaCl溶液制備的堿性電解水脫蛋白質(zhì)程度更高。

3 結(jié)論和討論

為了實(shí)現(xiàn)蟹殼中鈣源與甲殼素的綜合利用，研究了乳酸與堿性電解水聯(lián)合處理對(duì)礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的脫除程度的影響，并對(duì)制備的乳酸鈣進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)乳酸鈣制備條件的優(yōu)化，9倍稀釋的乳酸（1.14 mol/L）以1∶10（g/mL）的料液比于25℃下與蟹殼中的鈣鹽發(fā)生中和反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為2 h，最終乳酸鈣的最高產(chǎn)量為0.89 g/g蟹殼粉，礦物質(zhì)脫除率為94.37%，Zakaria等利用副干酪乳桿菌A3發(fā)酵螯蝦廢料，5 d后礦物質(zhì)脫除率為61.0%[18]；Rao M S等用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的pH，并維持在6.0，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌脫除蝦殼中礦物質(zhì)達(dá)88%[19]，由此可見(jiàn)，相對(duì)于乳酸菌發(fā)酵法而言，利用乳酸脫礦物質(zhì)效果更好，礦物質(zhì)脫除程度更高。并且制備的乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到99.37%，加熱減量分?jǐn)?shù)為7.06%，鎂、鉛和砷元素含量以及水溶解試驗(yàn)、游離酸和游離堿試驗(yàn)、揮發(fā)性脂肪酸試驗(yàn)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。然后將乳酸脫礦物質(zhì)后的殘?jiān)?%NaCl溶液制備的堿性電解水脫蛋白，蛋白質(zhì)含量由52%減少到7.53%，蛋白質(zhì)脫除率為90.54%，灰分含量為0.81%，該試驗(yàn)結(jié)果要優(yōu)于W.J.Jung等從蟹殼中篩選出的產(chǎn)蛋白酶菌株粘質(zhì)沙雷氏菌-FS3的脫礦物質(zhì)和脫蛋白效果[20]。并且1%NaCl溶液制備的堿性電解水較0.1%NaCl溶液制備的堿性電解水脫蛋白程度更高。試驗(yàn)表明，用乳酸和堿性電解水聯(lián)合處理能較好的實(shí)現(xiàn)脫礦物質(zhì)和脫蛋白質(zhì)制備乳酸鈣和甲殼素，實(shí)現(xiàn)蟹殼資源的有效利用。

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