IL-1β、IL-6及下游IDO激活與大鼠抑郁行為的關(guān)系研究*

伏簫燕，李海燕，崔 婷，蔣青松，邱紅梅

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室/重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400016)

抑郁癥是一種以情緒低落、興趣缺失為主要表現(xiàn)的常見精神障礙性疾病，具有不易察覺，病程長(zhǎng)，嚴(yán)重者導(dǎo)致自殺等特征。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種病理生理學(xué)改變。近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫激活及下游吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)通路激活與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。眾所周知，機(jī)體在免疫激活狀態(tài)下，免疫細(xì)胞如單核-巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等可釋放多種細(xì)胞因子，如白介素、腫瘤壞死因子等與相應(yīng)受體結(jié)合調(diào)控免疫應(yīng)答。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是重要的促炎性細(xì)胞因子，在免疫反應(yīng)和炎癥的啟動(dòng)和維持中發(fā)揮十分重要的作用，是炎性反應(yīng)系統(tǒng)被激活的直接標(biāo)志。國(guó)內(nèi)外研究顯示抑郁患者血清IL-1β、IL-6等促炎性細(xì)胞因子均顯著升高，提示細(xì)胞因子合成、釋放增多參與了臨床抑郁癥的發(fā)生[3]。腦內(nèi)5-羥色胺(serotonin，5-HT)功能不足是公認(rèn)的抑郁癥發(fā)病機(jī)制之一，也是臨床治療藥物的重要靶點(diǎn)。色氨酸作為腦內(nèi)合成5-HT的前體物質(zhì)，是機(jī)體所需的必需氨基酸之一，主要通過色氨酸-5-HT通路和色氨酸-犬尿氨酸通路進(jìn)行代謝。新的5-HT學(xué)說認(rèn)為，神經(jīng)炎癥因子增多，誘導(dǎo)色氨酸主要沿色氨酸-犬尿氨酸代謝，而使5-HT合成減少是抑郁癥發(fā)病的機(jī)制之一。IDO是一種色氨酸降解酶，是肝臟以外唯一可催化色氨酸沿色氨酸-犬尿氨酸途徑代謝的第一限速酶[4]。IDO在生理狀態(tài)下低水平表達(dá)，但在促炎癥細(xì)胞因子如IL-1、TNF等釋放增多及免疫激活時(shí)可誘導(dǎo)其表達(dá)顯著升高，催化色氨酸沿色氨酸-犬尿氨酸通路代謝，繼而導(dǎo)致色氨酸耗竭和5-HT合成減少，誘發(fā)或加重抑郁癥[5-7]。最新臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果均顯示炎癥因子釋放增多、IDO過表達(dá)與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。目前，臨床研究主要集中于對(duì)患者血清或腦脊液，基礎(chǔ)研究主要采用腦內(nèi)注射脂多糖或β-淀粉樣蛋白等誘導(dǎo)動(dòng)物抑郁行為并研究腦內(nèi)炎癥因子及IDO表達(dá)變化，尚未見采用慢性不可預(yù)見刺激(CUS)誘導(dǎo)動(dòng)物抑郁癥并研究腦內(nèi)皮層和海馬炎癥因子及IDO表達(dá)異常的報(bào)道。

研究已證實(shí)社會(huì)壓力、環(huán)境變化等慢性刺激是誘發(fā)抑郁癥的重要因素之一。CUS可模擬人所處的各種社會(huì)環(huán)境變化，是誘導(dǎo)建立動(dòng)物抑郁癥的常用模型之一。本研究采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS建立大鼠抑郁模型，采用Western blot和PCR研究抑郁大鼠大腦皮層及海馬IL-1β、 IL-6及IDO表達(dá)與動(dòng)物抑郁行為的關(guān)系，進(jìn)一步探索抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，5只/籠，自由攝食飲水，室溫(23±3)℃，醫(yī)學(xué)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(渝)2012-0001。

1.1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、垂直電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司)；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix、PCR引物(日本Takara生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)；anti IL-1β、anti IL-6(美國(guó)Affinity公司)；anti-IDO(美國(guó)Abcam公司)；其余各試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1分組及建模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，將得分相似的大鼠分為對(duì)照組(CG組)和模型組(MG組)。CG組大鼠5只/籠，自由攝食飲水，不予刺激。MG組大鼠采用孤養(yǎng)(1只/籠)結(jié)合CUS誘導(dǎo)建立大鼠抑郁癥模型。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期造模方法并稍加修改，采用的刺激方式包括空籠+禁食、噪音3 h、閃頻3 h、熱水浴5 min(45 ℃)、冰水浴5 min(4 ℃)、通宵照明、潮濕墊料24 h、傾斜24 h、夾尾1 min、禁飲禁食24 h、電擊5 min、晝夜顛倒、水平振蕩10 min，每天隨機(jī)給予一種刺激，4 d內(nèi)不出現(xiàn)同種刺激方式。

1.2.2開場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 使用規(guī)格為100 cm×100 cm×40 cm內(nèi)部涂為黑色的木質(zhì)敞箱，箱底部使用白色膠帶均分成20 cm×20 cm的正方形格子。在昏暗安靜的環(huán)境中，將大鼠至于中央格，四爪著地后開始計(jì)時(shí)，記錄大鼠5 min內(nèi)穿越格子數(shù)(四爪進(jìn)入視為1次)、水平站立數(shù)、整理次數(shù)及大小便次數(shù)，相加得開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分。

1.2.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 在安靜的環(huán)境中，將被測(cè)試大鼠放入高60 cm、直徑20 cm、水深30 cm的透明圓柱形玻璃桶中，水溫(23±3)℃，經(jīng)過2 min的適應(yīng)期后，記錄后5 min內(nèi)的累積不動(dòng)時(shí)間。

1.2.4取材 在實(shí)驗(yàn)第29天以4%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉后斷頭取腦，于冰上分離前腦皮層和海馬并置于凍存管中，立即放入液氮中短期保存，后放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5qRT-PCR法測(cè)定海馬和皮層的IDO mRNA的表達(dá) 分別取海馬和皮層40～100 mg，使用通過DEPC水浸泡過的勻漿器研磨(注意該過程使用的槍頭鑷子等均高壓滅酶)，用Trizol提取樣本總RNA，并測(cè)定總RNA濃度，以1 μg/20 μL為反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)參照Genbank中大鼠的基因序列(由Takara公司設(shè)計(jì)合成)。IDO：上游引物5′-GAC ACC TTT TTC CAC GTT CTT C-3′，下游引物5′-TCA CCA ACG TCA TGC TTT ATT C-3′，長(zhǎng)度185 bp；β-actin：上游引物5′-GCA GGA GTA CGA TGA GTC CG-3′，下游引物5′-CCT GAC AAT GAC TCG ACG CA-3′，長(zhǎng)度74 bp。利用SYBR Green熒光技術(shù)在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)果以Ct值表示，以2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6Western blot法檢測(cè)IL-1β、IL-6及IDO蛋白的表達(dá) 海馬和皮層分別稱取40～100 mg，在冰上加入裂解液后研磨，提取總蛋白，并用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，按總體積的4∶1的比例加入上樣緩沖液沸水煮10 min。每孔上樣30 μg，按順序采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2.5 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗(以β-actin為內(nèi)參)4 ℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，洗膜后用發(fā)光液(Advanstor 公司)顯色，凝膠成像儀成像后，用Image Lab軟件(Bio-Rad)分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理及作圖，組間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1孤養(yǎng)結(jié)合CUS對(duì)大鼠行為學(xué)的影響 MG組大鼠與CG組相比，其開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分顯著降低(P<0.01)；與CG組大鼠相比，MG組大鼠不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，見圖1。孤養(yǎng)結(jié)合CUS成功誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮、絕望樣抑郁行為，模型建立成功。

A：對(duì)開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分的影響；B：對(duì)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

圖1孤養(yǎng)結(jié)合CUS對(duì)大鼠行為學(xué)測(cè)試的影響

2.2孤養(yǎng)結(jié)合CUS對(duì)大鼠皮層和海馬IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)的影響 與CG組相比，MG組大鼠皮層和海馬IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，見圖2。

A：大鼠皮層IL-1β蛋白表達(dá)變化；B：大鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)變化；C：大鼠皮層IL-6蛋白表達(dá)變化；D：大鼠海馬IL-6蛋白表達(dá)變化

圖2 Western blot法檢測(cè)抑郁大鼠腦內(nèi)IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)變化

2.3孤養(yǎng)結(jié)合CUS對(duì)大鼠皮層和海馬IDO mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與CG組相比，MG組大鼠皮層和海馬IDO mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.01)，見圖3。

A：大鼠皮層IDO mRNA表達(dá)變化；B：大鼠海馬IDO mRNA表達(dá)變化；C：大鼠皮層IDO蛋白表達(dá)變化；D：大鼠海馬IDO蛋白表達(dá)變化

圖3 qRT-PCR法及Western blot檢測(cè)大鼠腦內(nèi)IDO mRNA及蛋白表達(dá)變化

3 討 論

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及社會(huì)、遺傳、環(huán)境等眾多因素。目前，國(guó)內(nèi)外抑郁癥的臨床治療和研究方向均主要集中在單胺遞質(zhì)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，但該類藥物治療無(wú)效率高達(dá)30%～40%，且治療后也可能出現(xiàn)抑郁癥狀持續(xù)存在及復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]，給家庭及社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，進(jìn)一步探索抑郁癥發(fā)病機(jī)制，尋找藥物防治新靶點(diǎn)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用CUS建立大鼠抑郁模型[10]，該模型可模擬抑郁患者在社會(huì)環(huán)境中接受的多種慢性刺激，是常用的慢性抑郁癥模型之一。在行為學(xué)指標(biāo)測(cè)定中，開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和被動(dòng)游泳是評(píng)價(jià)大鼠抑郁行為的常用指標(biāo)。結(jié)果顯示，與CG組相比，MG組大鼠開場(chǎng)試驗(yàn)得分顯著降低，提示其對(duì)新異環(huán)境的探究行為顯著下降；MG組大鼠被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，提示其出現(xiàn)顯著焦慮、絕望樣抑郁行為改變，模型建立成功。

應(yīng)激作為抑郁癥發(fā)生的常見危險(xiǎn)因素，可通過激活免疫系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞因子釋放而參與臨床抑郁癥的發(fā)生[11]。“抑郁癥的細(xì)胞因子學(xué)說”指出，抑郁癥的發(fā)生可能與炎癥細(xì)胞因子釋放及IDO激活等因素相關(guān)。細(xì)胞因子是一類主要由活化的免疫細(xì)胞合成和釋放的可參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、組織損傷修復(fù)等的可溶性小分子蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子在體內(nèi)形成復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，通過旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式發(fā)揮相應(yīng)的生理或病理作用。在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均發(fā)現(xiàn)有炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放增多，包括IL-1β、IL-6等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，這些炎癥細(xì)胞因子可能通過影響神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和5-HT代謝障礙參與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展，但尚缺乏系統(tǒng)研究[12-13]。目前，大量研究均發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清及腦脊液IL-1β、IL-6等炎癥因子顯著升高[14-18]，提示這些細(xì)胞因子的激活可能參與了抑郁癥的發(fā)生，但缺乏大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子變化的相關(guān)研究資料。研究結(jié)果顯示，與CG組相比，MG組大鼠大腦皮層及海馬IL-1β、 IL-6蛋白表達(dá)顯著增加，提示大鼠抑郁行為與腦內(nèi)炎癥因子表達(dá)增高密切相關(guān)，并與前述臨床研究結(jié)果相互印證。IDO是一種細(xì)胞內(nèi)的含亞鐵血紅素的酶，是催化色氨酸沿犬尿氨酸通路代謝的限速酶。多種炎癥細(xì)胞因子可通過過度激活I(lǐng)DO，誘導(dǎo)色氨酸主要沿犬尿氨酸途徑代謝，引起色氨酸耗竭并繼發(fā)5-HT合成不足，同時(shí)該途徑產(chǎn)生的3-羥犬尿氨酸、喹啉酸等神經(jīng)毒性產(chǎn)物也可能參與了抑郁癥的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與CG組相比，MG組大鼠海馬和皮層IDO mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高，提示腦內(nèi)出現(xiàn)IDO過度激活，繼而可能導(dǎo)致色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑的過度激活，造成色氨酸耗竭和5-HT合成不足，參與抑郁癥的發(fā)病。

綜上所述，孤養(yǎng)結(jié)合CUS誘導(dǎo)大鼠抑郁行為可能與腦內(nèi)炎癥因子表達(dá)增高并誘導(dǎo)IDO過表達(dá)密切相關(guān)，在下一步實(shí)驗(yàn)中筆者將采用IDO拮抗劑及炎癥因子拮抗劑來驗(yàn)證這一推測(cè)。

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