耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測(cè)與分子流行病學(xué)研究*

楊 雪，劉 琳，趙 丹，張湘燕△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550000；2.貴州省人民醫(yī)院，貴陽(yáng) 550000)

肺炎克雷伯菌是臨床最常見的條件致病菌之一，可引起肺炎、尿路感染、敗血癥、傷口感染、腦膜炎等[1]。近年來(lái)隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，尤其是第3代頭孢菌素及碳青霉烯類的不合理使用，導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性。2015年我國(guó)耐藥細(xì)菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)提供的數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥率為7.6%，各省為0.5%～20.0%，均較2014年有所增加[2]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的感染增加了臨床治療的難度和患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。本研究收集37株CRKP菌株，檢測(cè)相關(guān)耐藥基因，采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)其進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，以揭示其耐藥克隆的特征，以期為防治CRKP的傳播提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 隨機(jī)選取2016年2月至2017年2月貴州省人民醫(yī)院臨床分離到的CRKP，排除同一患者重復(fù)菌株，共37株。標(biāo)本來(lái)源包括痰液、血液、中段尿、腹腔積液等。菌株經(jīng)美國(guó)BD公司Phoenixtm-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測(cè)。

1.1.2主要試劑 藥敏紙片及M-H平板均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，0.5 mol/L的EDTA溶液為本室所有；2×Taq Master Mix和離心柱型細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒均購(gòu)自北京康維世紀(jì)有限公司。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3主要儀器 全自動(dòng)微生物鑒定儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌鑒定、藥敏試驗(yàn)及表型確證 采用Phoenixtm-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，用微量肉湯稀釋法測(cè)定13種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，結(jié)果判定按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2015年版標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行；質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922及K.pneumoniae標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700603均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。碳青霉烯類檢測(cè)參照CLSI介紹使用改良霍奇實(shí)驗(yàn)。金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)采用亞胺培南+EDTA復(fù)合紙片的雙紙片協(xié)同法。

1.2.2耐藥基因檢測(cè) PCR法檢測(cè)A類(KPC-2、GES)、B類(IMP、VIM、NDM-1)和D類OXA-48耐藥基因。參照GeneBank中目的基因的標(biāo)準(zhǔn)序列及相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物[3-4]。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，滅菌蒸餾水19 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，退火溫度1 min，72 ℃延伸1 min，38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，見表1。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠中經(jīng)110 V電泳1 h后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程公司完成測(cè)序，結(jié)果用 BLAST軟件與Genbank上已公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 耐藥基因引物擴(kuò)增序列及退火溫度

1.2.3MLST實(shí)驗(yàn) 根據(jù)MLST網(wǎng)站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.h-tml)提供的引物序列，擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因，包括gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB及tonB，引物序列及退火溫度見表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后拍照并送至上海生工生物工程公司測(cè)序。將測(cè)序所得到的結(jié)果在肺炎克雷伯菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)官方網(wǎng)站 (https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_mlst_seqdef&set_id=13&page=sequ-enceQuery)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到每個(gè)管家基因的等位基因編號(hào)，和數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列不能完全比對(duì)的，經(jīng)再次PCR及測(cè)序后確認(rèn)為新的等位基因型，將序列及測(cè)序文件遞交至數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得新的命名。將7個(gè)管家基因所得到的編號(hào)按照gapA-infB-mdh-pgi-phoE-rpoB-tonB組合，與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中已有管家基因譜進(jìn)行比對(duì)，得到每株細(xì)菌對(duì)應(yīng)的ST型。

1.2.4MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹、eBURST軟件分析親緣關(guān)系 將本研究獲得的等位基因序列數(shù)據(jù)及ST信息使用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹、eBURST軟件進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

1.2.5臨床資料的分析 對(duì)37株細(xì)菌的臨床資料進(jìn)行收集整理，包括感染者性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、感染途徑、住院病房、侵入性操作、感染CRKP前抗菌藥物使用情況、預(yù)后情況、住院時(shí)間等，將其分成ST11型組及非ST11型組。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。年齡、住院時(shí)間的組間比較采用t檢驗(yàn)，其他項(xiàng)目的組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 管家基因引物擴(kuò)增序列及退火溫度

2 結(jié) 果

2.1藥敏結(jié)果 37株CRKP對(duì)13種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，對(duì)碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南)呈現(xiàn)不同程度耐藥，4～256 μg/mL。對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素、第3代頭孢菌素頭孢曲松及臨床上常用的抗菌藥物聯(lián)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦)均出現(xiàn)高水平耐藥，較為特別的是，哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率為91.9%，32～256 μg/mL。而對(duì)阿米卡星耐藥率稍低，為89.2%，1～256 μg/mL；對(duì)于阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢西丁、頭孢他啶耐藥率均為97.3%。

2.2改良霍奇實(shí)驗(yàn)及金屬酶檢測(cè)結(jié)果 改良霍奇實(shí)驗(yàn)顯示37株菌株均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率100%，金屬酶檢測(cè)結(jié)果有3株陽(yáng)性，陽(yáng)性率為8.1%。

2.3耐藥基因檢測(cè) PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，37株菌株均含有KPC-2基因，檢出率最高，有3株同時(shí)含有NDM-1基因，均未檢出OXA-48、GES、IMP、VIM基因。所有陽(yáng)性基因均經(jīng)測(cè)序，BLAST軟件與Genbank上已公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性均大于或等于99.0%，見圖1、2。

M：Marker600D；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照；1～5：菌株編號(hào)

圖1 KPC-2基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

M：Marker600D；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照；6、26、27：菌株編號(hào)

圖2 NDM-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.4MLST及分子遺傳學(xué)結(jié)果分析 37株菌株經(jīng)7個(gè)管家基因的PCR結(jié)果測(cè)序比對(duì)，可分為8個(gè)ST型，以ST11 25株為主，其次為ST789 4株、ST524 2株，ST35、ST29、ST1066及ST244各1株。有1個(gè)新的ST型已被PubMlst數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)收錄并命名為ST2792(2株)，見圖3、4。

2.5臨床資料分析 通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，ST11型組及非ST11型組在年齡、性別、感染途徑、抗菌藥物使用情況及住院時(shí)間等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但總體而言，感染者年齡大、住院時(shí)間長(zhǎng)、基礎(chǔ)疾病多、入院后有較多的侵入性操作、使用多種抗菌藥物治療都是CRKP感染的潛在原因。

圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)ST，藍(lán)色代表各自克隆復(fù)合體的祖先，黃色代表各自克隆復(fù)合體亞群的原始型，標(biāo)有紅色圓圈切帶有數(shù)字的點(diǎn)表示本次研究中所得到的ST型，其他黑色的點(diǎn)表示本次試驗(yàn)外數(shù)據(jù)庫(kù)中的ST

圖3 eBURST軟件分析結(jié)果

圖4 META分析構(gòu)建37株菌株進(jìn)化

3 討 論

產(chǎn)生碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因[5]。目前，碳青霉烯酶包括Ambler分類中的A、B、D類。A類主要水解除頭霉素類以外的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，包括KPC、GES等；B類能水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物，但不能水解氨曲南，主要包括IMP、VIM、NDM-1等；D類為苯唑西林水解酶，主要為OXA-48。本研究中37株菌株改良霍奇實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，且經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)全部攜帶KPC-2基因，僅有3株同時(shí)攜帶NDM-1基因，未發(fā)現(xiàn)GES、IMP、VIM、OXA-48基因，說(shuō)明KPC-2是CRKP對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的原因，與國(guó)內(nèi)外研究一致[6-8]。攜帶KPC-2基因的CRKP菌株對(duì)本研究中的13種抗菌藥物均呈現(xiàn)了高水平耐藥，耐藥率基本達(dá)到90%以上，多耐藥、高水平耐藥情況嚴(yán)重；而同時(shí)攜帶KPC-2和NDM-1的菌株對(duì)包括氨曲南在內(nèi)的13種抗生素全部耐藥，但其耐藥水平并未高于只攜帶KPC-2基因的耐藥菌株，說(shuō)明同時(shí)攜帶多種碳青霉烯酶基因可以擴(kuò)大耐藥范圍，但并不一定提高耐藥水平。目前已有研究證實(shí)，KPC-2編碼的基因位于T4401的轉(zhuǎn)座子上[9]，毛彩萍等[10]在KPC-2基因陽(yáng)性的菌株中檢測(cè)到插入序列ISKpn6，且這兩個(gè)基因連鎖排列；這導(dǎo)致KPC-2基因可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子、插入序列等方式在不同菌株間傳播[11]，造成爆發(fā)流行。

本研究中37株菌株主要來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)室ICU(24.3%)、神經(jīng)內(nèi)科ICU(27.0%)、呼吸內(nèi)科ICU(8.1%)、神經(jīng)外科(10.8%)等；標(biāo)本類型主要為痰(73%)和尿(11%)，可能與患者基礎(chǔ)疾病重，住院時(shí)間長(zhǎng)，使用多種抗菌藥物及進(jìn)行侵入性操作有關(guān)[12]。利用MLST對(duì)37株菌株進(jìn)行分型及建立進(jìn)化樹，得到包括ST11(25株)、ST524(2株)、ST35(1株)、ST1066(1株)、ST29(1株)、ST244(1株)、ST789(4株)及新發(fā)現(xiàn)的ST2792(2株)在內(nèi)的8種ST型，其中ST11是最流行的克隆型，這也是我國(guó)CRKP最主要的ST型別[13]。本研究新發(fā)現(xiàn)的ST2792與最流行的ST11有高度的親緣關(guān)系，僅有1個(gè)管家基因(infB)發(fā)生了變異，其攜帶的耐藥基因也與ST11一致，且耐藥性也無(wú)明顯差別。將ST11型與非ST11型菌株的臨床資料進(jìn)行了對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩組在年齡、基礎(chǔ)疾病、使用抗生素種類及住院時(shí)間等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明ST11型并沒(méi)有感染CRKP的特有風(fēng)險(xiǎn)。這與DHAR等[14]的研究結(jié)果相似，可能由于這些ST型基本上同屬一個(gè)克隆群，少數(shù)位點(diǎn)的變異并不會(huì)給臨床感染帶來(lái)特殊風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KPC-2基因?yàn)樽盍餍械哪退幓?，同時(shí)含有NDM-1的菌株，也應(yīng)引起重視。MLST結(jié)果顯示ST11型為最流行的克隆型，新發(fā)現(xiàn)的ST2972與其為同一克隆系。在同一區(qū)域不同時(shí)間可能存在相同基因型或克隆群的CRKP的流行，臨床及相關(guān)檢驗(yàn)科室需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，避免耐藥菌株的播散。然而，本研究未對(duì)其他耐藥機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)，可能存在一定的局限性，因此還有待進(jìn)一步研究和更多實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。

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