自然變溫下小葉蚊母樹葉片生理指標(biāo)及組織結(jié)構(gòu)變化

姜新強，李璐璐，劉慶超，劉慶華，王奎玲*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與林學(xué)院，山東 青島 266109; 2.北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京 100083)

小葉蚊母樹(Distyliumbuxifolium)是金縷梅科蚊母樹屬常綠小灌木，在亞熱帶地區(qū)分布廣泛，其葉色濃綠，早春2—4月開花，花朵紫紅色，花量大，觀賞價值較高，廣泛用于室內(nèi)外園林綠化[1]，已在南京等地成功引種栽培[2]。秋冬季節(jié)持續(xù)低溫是小葉蚊母樹在北方地區(qū)露地栽植應(yīng)用的主要限制因子。低溫能夠破壞植物細胞結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，造成植物體內(nèi)代謝失調(diào)[3]，影響正常的生長發(fā)育，嚴(yán)重時造成植物死亡。然而，當(dāng)植物遭受低溫脅迫時，植物可以通過改變其組織器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)[4]和多種代謝途徑來抵抗所受到的低溫脅迫，包括滲透保護物質(zhì)的積累、抗氧化酶系統(tǒng)的激活以及抗逆蛋白質(zhì)的合成等方面[5-6]。小葉蚊母樹具有一定的抗寒性，其葉片半致死溫度為-6.23 ℃[7]。明確小葉蚊母樹葉片在低溫下的生理適應(yīng)機制對于揭示其耐寒機制和篩選抗寒種質(zhì)資源具有十分重要的意義。鑒于此，以自杭州引種至青島地區(qū)露地栽培的小葉蚊母樹為試驗材料，通過測定其在秋冬季節(jié)自然變溫過程中不同時期葉片組織結(jié)構(gòu)、葉片相對電導(dǎo)率和相關(guān)生理指標(biāo)的變化，探究小葉蚊母樹的抗寒性和對自然變溫的適應(yīng)機制，為其北引栽培和培育耐寒種質(zhì)提供詳實的科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為 2 年生小葉蚊母樹植株，露地栽植于即墨市普東鎮(zhèn)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地中。2015年10月至2016年4月每月中旬在天氣晴朗的上午10:00—12:00進行取樣。在30株小葉蚊母樹中選取生長健壯、受光均勻的3株植株，每株取向陽面枝條頂端向下第4節(jié)生長健壯的成熟葉片15片，隨機分為3個重復(fù)，每個重復(fù)取5片葉片用于觀察葉片組織結(jié)構(gòu)。試驗期間月平均最低溫度分別為17、11、4、-2、-7、-2、3 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 相對電導(dǎo)率及生理指標(biāo)測定 取1.1中葉片用于電導(dǎo)率和生理指標(biāo)的測定。參照趙世杰等[8]的方法測定小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率；葉片丙二醛(MDA)、可溶性蛋白和脯氨酸含量測定參考王學(xué)奎[9]的方法；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參考Giannopolitis等[10]的方法，以每單位時間內(nèi)抑制光還原50%的四氮唑藍(NBT)為1個酶活性單位，5個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 葉片組織結(jié)構(gòu)觀測 采用常規(guī)石蠟切片法觀察小葉蚊母樹葉片組織結(jié)構(gòu)，用蒸餾水沖洗葉片，在主脈及兩側(cè)取0.5 cm×1.0 cm樣品，保存于FAA固定液中，真空泵抽氣后備用。切片厚度為8 μm，番紅、固綠雙重染色后用中性樹膠封片，在Olympus CX31(CX31, Olympus, Japan)光學(xué)顯微鏡下觀察，每個樣品統(tǒng)計2個視野，每個月份統(tǒng)計30張照片。用Image J軟件測量葉片中脈厚度，葉片厚度，上、下表皮細胞厚度，柵欄組織厚度，海綿組織厚度。參考Lianopoulou等[11]的方法，計算柵欄組織相對體積比，海綿組織相對體積比，上、下表皮細胞相對體積比。參考馬建靜等[12]的方法，計算細胞體積與細胞長寬比。

上表皮細胞相對體積比=上表皮細胞厚度/葉片厚度×100%,

下表皮細胞相對體積比=下表皮細胞厚度/葉片厚度×100%,

柵欄組織相對體積比=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%,

海綿組織相對體積比=海綿組織厚度/葉片厚度×100%,

細胞體積= π·(細胞寬度/2)2×細胞長度(0.38+0.117×細胞長度/細胞寬度),

細胞長寬比=細胞長度/細胞寬度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均通過Excel 2013進行整理，利用SPSS 21.0進行差異顯著性分析。采用單因素(one-way ANOVA) 和最小顯著差異法(LSD)進行方差分析和多重比較(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然變溫過程中的細胞膜透性的變化

由圖1可知，2016年2月以前，隨著月平均最低溫度的降低，葉片相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)升高的趨勢，2016年2月(月平均最低氣溫為-7 ℃)葉片相對電導(dǎo)率最高，為58.90%，相比于2015年10月升高了276.88%，顯著高于其他時期。2016年3月和4月，隨著月平均最低溫度的上升，小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率下降，分別降至27.34%和23.23%。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P≤0.05)，下同

圖12015年10月至2016年4月月平均最低溫度和小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率

2.2 自然變溫過程中的葉片生理指標(biāo)的變化

如圖2所示，小葉蚊母樹葉片SOD活性、MDA、可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。2016年2月和3月葉片SOD活性顯著高于其他月份，2016年3月SOD活性分別為2015年10月和2016年4月的1.67和1.73倍；MDA和脯氨酸含量最大值均出現(xiàn)在2016年2月，分別為14.34 μmol/g和226.16 μg/g，均顯著高于其他月份，MDA 含量最低值出現(xiàn)在2016年3月，為5.64 μmol/g，脯氨酸含量最低值為98.73 μg/g，出現(xiàn)在2015年10月；2016年1—2月的葉片可溶性蛋白含量顯著高于其他時期。

2.3 自然變溫過程中的葉片組織結(jié)構(gòu)的變化

選取小葉蚊母樹2015年10月、2016年1月和4月葉片對其組織結(jié)構(gòu)進行切片觀察，結(jié)果見圖3。

圖2 2015年10月至2016年4月小葉蚊母樹葉片生理指標(biāo)的變化

由圖3可以看出，小葉蚊母樹葉片為不等面葉，不同時期葉片均由上表皮細胞、柵欄組織、海綿組織和下表皮細胞構(gòu)成，維管束由木質(zhì)部和韌皮部組成。葉脈維管束為半圓形，韌皮部外側(cè)有木化的韌皮纖維。2015年10月葉片柵欄組織細胞排列較疏松(圖3A、D)，細胞間隙較大，2016年1月(圖3B、E) 和4月(圖3C、F) 葉片柵欄組織細胞排列較緊密。2016年1月葉脈皮層組織出現(xiàn)分層現(xiàn)象(圖3B)，細胞從排列最松散處分開且向四周擴展形成空隙(圖3B、C框內(nèi))，2016年4月空隙變小。

A—C 分別為2015年10月、2016年1月和2016年4月小葉蚊母樹葉中脈解剖結(jié)構(gòu)；D—F 分別為2015年10月、2016年1月和2016年4月小葉蚊母樹葉葉肉解剖結(jié)構(gòu)。X:木質(zhì)部細胞; P:韌皮部細胞; UE:上表皮細胞; PP:柵欄組織細胞; PF:纖維細胞; SP:海綿組織細胞; LE:下表皮細胞

圖4 自然變溫過程中小葉蚊母樹葉片解剖結(jié)構(gòu)特征

對自然變溫過程中小葉蚊母樹葉片中脈厚度，葉片厚度，上、下表皮細胞厚度，柵欄組織厚度，海綿組織厚度，柵欄組織相對體積比，海綿組織相對體積比，上表皮細胞相對體積比，下表皮細胞相對體積比等11個指標(biāo)進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖4所示。2016年1月葉片厚度顯著高于2015年10月和2016年4月，相比于2015年10月葉片厚度增加了27.7%，達到373.35 μm；2015年10月、2016年1月和2016年4月小葉蚊母樹葉中脈厚度無顯著性變化，最高值出現(xiàn)在2016年4月，為583.02 μm(圖4a)。小葉蚊母樹不同時期上、下表皮細胞、柵欄組織和海綿組織在葉片中所占體積不同(圖4b)。2015年10月柵欄組織相對體積比顯著低于2016年1月和4月，而海綿組織相對體積比顯著高于2016年1月和4月；上表皮細胞相對體積比最大值出現(xiàn)在2016年4月，為7.1%，顯著高于2015年10月(5.8%) 和2016年1月(6.0%)，2016年1月和4月下表皮細胞相對體積比均為4.3%，顯著高于2015年10月(3.7%)；2016年4月海綿組織體積最大，為5 177.92 μm3(圖4c)，2016年1月和4月柵欄組織細胞體積顯著高于2015年10月(圖4c)；柵欄組織細胞長寬比最大值出現(xiàn)在2016年1月(1.30)，顯著高于2016年4月(圖4d)，與2015年10月之間無顯著性差異；2016年4月海綿組織細胞長寬比顯著高于2015年10月和2016年1月(圖4d)。

3 結(jié)論與討論

溫度與植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)實等生物學(xué)過程密切相關(guān)，是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，貫穿于植物生長的全部過程。在低溫脅迫下，植物細胞和組織穩(wěn)定性遭到破壞，葉片表現(xiàn)出萎篶、凍斑、焦枯，枝條變黑等受害癥狀[13]。但是經(jīng)過短暫或長期的低溫馴化后，植物也可以通過改變自身細胞、組織結(jié)構(gòu)和生理代謝過程以增強細胞和組織穩(wěn)定性，提高對低溫環(huán)境的適應(yīng)性。本研究對自然變溫過程中的小葉蚊母樹的葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)變化進行了觀測，發(fā)現(xiàn)其可以通過改變自身組織結(jié)構(gòu)和積累生理代謝性物質(zhì)以提高對低溫環(huán)境的適應(yīng)能力。

植物葉片是進行光合作用的主要器官，對溫度敏感且可塑性較大。葉片可以通過自身組織結(jié)構(gòu)的改變以增強對低溫環(huán)境適應(yīng)性[14-15]。研究表明，擬南芥葉片暴露在低溫中15 d，葉片解剖結(jié)構(gòu)就會發(fā)生不可逆的改變以適應(yīng)低溫環(huán)境[16]。對木本植物腰果(Anacardiumoccidentale)[17]、北海道黃楊(Euonymusjaponicus‘Cu Zhi’)[18]和油棕(Elaeisguineensis)[19]的研究均表明，低溫能夠使葉片結(jié)構(gòu)出現(xiàn)適應(yīng)性的變化，如葉片厚度增大，組織緊密度增加等以適應(yīng)低溫環(huán)境。本研究對小葉蚊母樹2015年10月、2016年1月和4月葉組織結(jié)構(gòu)不同參數(shù)的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在溫度較低的2016年1月(平均最低溫度-7 ℃)，小葉蚊母樹葉片厚度、柵欄組織細胞體積顯著高于溫度較高的2015年10月。隨著溫度的降低，小葉蚊母樹葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生了對低溫的適應(yīng)性變化，并且葉片厚度的增加主要是由于葉片柵欄組織厚度增加。冬季(2016年1月)小葉蚊母樹葉片厚度和柵欄組織在葉片中所占比重增大能增強低溫環(huán)境中葉片對光能的利用效率以增加固碳能力，提高對低溫逆境的抵抗能力。柵欄組織厚度的增加是小葉蚊母樹適應(yīng)低溫環(huán)境的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，這與Poorter等[20]和Scheepens等[21]的研究結(jié)果一致。除細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變外，植物葉片對低脅迫的適應(yīng)性還體現(xiàn)在葉肉細胞生長模式和細胞尺寸上。Stefanowska等[22]研究表明，歐洲油菜(Brassicanapus)葉片在零度以上的低溫脅迫下，柵欄組織會由平行于葉表面方向伸長轉(zhuǎn)向垂直于葉表面方向伸長，葉肉細胞體積也會增大。小葉蚊母樹不同時期葉肉細胞體積與長寬比變化趨勢一致，由此推測冬季植物葉片柵欄組織細胞體積的增大原因可能是由于柵欄組織細胞垂直于葉片方向的生長。

除葉片組織結(jié)構(gòu)之外，植物還可以通過改變自身生理代謝物質(zhì)以增強自身抗寒性。葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量是衡量植物抗寒性的重要指標(biāo)，相對電導(dǎo)率反映了細胞電解液泄露程度，MDA是細胞膜過氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映細胞膜受害程度。2015年11月葉片 MDA 含量顯著高于2015年10月，并且在2015年10月至2016年2月期間維持在較高水平，說明在此期間細胞膜受到損傷，MDA 積累。2016年2月小葉蚊母樹葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量達到最大值，表明在此期間細胞膜受害程度和細胞電解液外泄程度最高，細胞受害最嚴(yán)重。

植物在遭受低溫、干旱等非生物脅迫時，會積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主動提高細胞對不良環(huán)境的抵抗能力[11]。在低溫脅迫時，細胞內(nèi)活性氧含量升高，造成細胞膜過氧化，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和功能[23]。而SOD能有效清除細胞體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧[24]，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。在自然變溫期間，小葉蚊母樹葉片SOD活性呈先升高后降低的趨勢，溫度比較低的2016年2月和3月 SOD 活性顯著高于其他時期，表明在此時期細胞對活性氧的清除能力提高，細胞自身的生理代謝能力增強；2016年3月MDA含量顯著降低，這可能與3月小葉蚊母樹葉片中SOD活性較高有關(guān)，較高活性的SOD降低了細胞膜脂質(zhì)過氧化水平?？扇苄缘鞍缀康脑黾佑欣谔岣呒毎麅?nèi)束縛水含量，從而降低冰點[25]。2016年1月和2月葉片可溶性蛋白含量顯著高于其他時期，這是由于植物通過葉片中可溶性蛋白的積累以增加防止細胞內(nèi)結(jié)冰的能力。作為細胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在低溫脅迫下，可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加可以增加細胞液濃度，降低細胞內(nèi)結(jié)冰溫度[26-27]。除了具有維持細胞內(nèi)滲透壓、結(jié)合蛋白質(zhì)以保護蛋白活性的功能外，脯氨酸還具有清除羥基自由基、保護細胞膜的功能[28]。對冬青(Ilexchinensis)[25]和櫻桃(Cerasuspseudocerasus)[29]的研究表明，葉片內(nèi)脯氨酸含量在低溫脅迫下均升高，與本研究結(jié)果一致。小葉蚊母樹脯氨酸含量的最大值出現(xiàn)在2016年2月，顯著高于其他時期，表明在此時期脯氨酸作為一種滲透條件物質(zhì)，能夠提高細胞液濃度，減弱低溫對細胞的傷害。

本研究通過揭示小葉蚊母樹在北方地區(qū)秋冬季節(jié)自然變溫過程中葉片結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)的變化，明確了小葉蚊母樹葉片能夠通過改變組織結(jié)構(gòu)、主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高抗氧化物酶活性等機制提高自身對低溫環(huán)境的適應(yīng)能力，揭示了小葉蚊母樹葉片越冬過程中的低溫適應(yīng)機制。但植物對低溫的適應(yīng)性狀是數(shù)量性狀，并且露地栽培過程中多種環(huán)境因素都會對其造成影響，對小葉蚊母樹在引種地僅進行了1 a的低溫適應(yīng)性觀測，未來還需要對引種植株進行更為全面的觀測，以明確其在低溫下的適應(yīng)性。

參考文獻:

[1] 何小勇,楊先裕,練發(fā)良.小葉蚊母樹冬季不同葉齡葉色及其光合特性研究[J].浙江林業(yè)科技,2015,35(5):6-10.

[2] 謝曉金,郝日明.南京地區(qū)引種的24種常綠闊葉樹種耐寒性比較[J].浙江林學(xué)院學(xué)報,2006,23(3):285-289.

[3] 蘭淑芝,李伯清.低溫對植物的影響[J].吉林農(nóng)業(yè),1997(8):19-20.

[4] England J R,Attiwill P M.Changes in stomatal frequency,stomatal conductance and cuticle thickness during leaf expansion in the broad-leaved evergreen species,Eucalyptusregnans[J].Trees,2011,25(6):987-996.

[5] 王達,馬紀(jì).植物耐寒機理與耐寒植物新品種培育[J].生物技術(shù)通報,2012(1):7-13.

[6] Foyer C H,Descourvières P,Kunert K J.Protection against oxygen radicals: An important defence mechanism studied in transgenic plants[J].Plant Cell and Environment,1994,17(5):507-523.

[7] 張鵬翀,王挺,劉錦,等.電導(dǎo)法配合Logistic方程測定5種高架綠化植物的抗寒性[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,40(19):49-50.

[8] 趙世杰,史國安,董新純.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[9] 王學(xué)奎.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].2版.北京：高等教育出版社，2006.

[10] Giannopolitis C N, Ries S K. Superoxide dismutaseⅡ. Purification and quantitative relationship with water-soluble protein in seedlings[J].Plant Physiology,1997,59(2):315-318.

[11] Lianopoulou V,Bosabalidis A M,Patakas A,etal.Effects of chilling stress on leaf morphology, anatomy, ultrastructure, gas exchange,and essential oils in the seasonally dimorphic plantTeucriumpolium(Lamiaceae)[J].Acta Physiologiae Plantarum,2014,36(8):2271-2281.

[12] 馬建靜,吉成均,韓梅,等.青藏高原高寒草地和內(nèi)蒙古高原溫帶草地主要雙子葉植物葉片解剖特征的比較研究[J].中國科學(xué)(生命科學(xué)),2012,42(2):158-172.

[13] 李璐璐,姜新強,劉慶超,等.茶梅葉片結(jié)構(gòu)對自然變溫的適應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2016,27(9):2815-2822.

[14] 李芳蘭,包維楷.植物葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)對環(huán)境變化的響應(yīng)與適應(yīng)[J].植物學(xué)通報,2005,22(S1):118-127.

[15] 覃鳳飛,李強,崔棹茗,等.越冬期遮陰條件下3個不同秋眠型紫花苜蓿品種葉片解剖結(jié)構(gòu)與其光生態(tài)適應(yīng)性[J].植物生態(tài)學(xué)報,2012,36(4):333-345.

[16] Gebrueder B, Berlin F C, Descourivesse P,etal. Protection against oxygen radicals:An important defense mechanism studied in transgenic plants[J].Plant Cell Environ,1994,17(5):507-523.

[17] 梁李宏,梅新,林鋒,等.低溫脅迫對腰果幼苗葉片組織結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2009,18(1):325-328.

[18] 馬妮,孫振元,劉慶華,等.北海道黃楊葉片解剖結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,33(6):112-118.

[19] 曹紅星,黃漢駒,雷新濤,等.不同低溫處理對油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響[J].熱帶作物學(xué)報,2014,35(3):454-459.

[20] Poorter H,Niinemets U,Poorter L.Causes and consequences of variation in leaf mass per area (LMA):A meta-analysis [J].New Phytologist,2009,182(3):565-588.

[21] Scheepens J F,Frei E S,St?cklin J.Genotypic and environmental variation in specific leaf area in a widespread Alpine plant after transplantation to different altitudes[J].Oecologia,2010,164(1):141-150.

[23] 康菊清,張岱鵬.低溫條件下中國野生擬南芥種群中CBF3與ROS濃度的相關(guān)性[J].植物學(xué)報,2016,51(5):577-585.

[24] 張玲玲,孫芳芳,溫達志.薇甘菊和飛機草抗氧化物和膜脂過氧化物對光照和土壤水分的響應(yīng)[J].植物生態(tài)學(xué)報,2009,33(5):974-983.

[25] 曾雯,金曉玲,邢文,等.9個常綠雜交冬青的抗寒能力比較[J].植物生理學(xué)報,2016,52(1):55-61.

[26] 周茹寶,張有福,張滿效,等.兩種圓柏屬植物葉片代謝產(chǎn)物季節(jié)變化與抗凍性的關(guān)系[J].冰川凍土,2008,30(2):351-355.

[27] 王以斌,繆錦來,姜英輝,等.脯氨酸和可溶性糖在南極冰藻低溫適應(yīng)機制中的作用[J].生物技術(shù)通報,2016,32(2):198-202.

[28] Walker D J,Romero P,Correal E.Cold tolerance,water relations and accumulation of osmolytes inBituminariabituminosa[J].Biologia Plantarum,2010,54(2):293-298.

[29] 王敏,陳秋芳,石美娟,等.低溫脅迫對甜櫻桃品種枝條SOD、POD活性和脯氨酸含量的影響[J].山西果樹,2011(6):3-5.