非小細(xì)胞肺癌組織p-mTOR、p70s6k、PTEN蛋白的表達(dá)變化及其意義

許浩然，何世杰，張秀義，景衛(wèi)革，孫亞東，王嘉

(1承德市中心醫(yī)院，河北承德067000 ；2河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院)

肺癌居我國惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的首位，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型。癌基因活化、抑癌基因失活可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞增殖異常[1]。腫瘤組織中常存在磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的過度活化。mTOR可加快細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。磷酸化的mTOR(p-mTOR)是該通路活化的生物學(xué)標(biāo)志[2]。核糖體40 S小亞基S6蛋白激酶(p70s6k)是p-mTOR下游直接作用底物，被p-mTOR磷酸化的p70s6k可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)生成核糖體、起始因子及延伸因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(PTEN)是抑癌基因，可抑制PI3K及Akt對mTOR的激活，使細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移。本研究觀察了NSCLC組織中p-mTOR、p70s6及PTEN的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2016年3月間在我院收治的NSCLC患者82例，其中男64例、女18例，年齡43～75(61.28±9.13)歲；組織學(xué)類型為鱗狀細(xì)胞癌42例，腺癌40例；高分化癌50例，低中分化癌32例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)前未進(jìn)行放、化療治療，術(shù)中留取癌組織標(biāo)本(肺癌組)。另選擇取自肺癌同側(cè)遠(yuǎn)端肺泡組織標(biāo)本46例份為肺泡組，正常支氣管黏膜標(biāo)本50例份為支氣管組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 兔抗人PTEN、p70s6k及p-mTOR單克隆抗體購自美國santa cruz公司，免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 PTEN、p70s6k及p-mTOR檢測方法 采用SP免疫組織化學(xué)法。應(yīng)用檸檬酸緩沖液修復(fù)，經(jīng)濃縮型DAB試劑顯色，蘇木素復(fù)染。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。以已知受檢蛋白的陽性病理切片作陽性對照，以PBS液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法分別觀察處理后切片，如出現(xiàn)結(jié)果判定不一致時(shí)，由第三名高年資病理科醫(yī)師做最后結(jié)果判定。p-mTOR在正常肺泡細(xì)胞及支氣管黏膜上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不顯色或呈淡灰黃色，為陰性或弱陽性表達(dá)，在NSCLC胞質(zhì)呈金棕黃色，為強(qiáng)陽性表達(dá)。PTEN在正常肺泡細(xì)胞及支氣管黏膜上皮胞質(zhì)呈金棕黃色，為強(qiáng)陽性表達(dá)，在NSCLC胞質(zhì)不顯色或呈淡灰黃色，為陰性或弱陽性表達(dá)。PTEN在正常肺泡細(xì)胞及支氣管黏膜上皮胞質(zhì)呈金棕黃色，為強(qiáng)陽性表達(dá)，在NSCLC胞質(zhì)不顯色或呈淡灰黃色，為陰性或弱陽性表達(dá)。以陽性細(xì)胞數(shù)占所觀察細(xì)胞總數(shù)百分比及染色強(qiáng)度綜合計(jì)算，陽性細(xì)胞數(shù)占所觀察細(xì)胞總數(shù)百分比：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；染色強(qiáng)度：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張病理切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，二者相加，≤3分判定為陰性，>3分判定為陽性。

2 結(jié)果

肺癌組、肺泡組、支氣管組p-mTOR陽性表達(dá)率分別為68.29%(56/82)、17.39%(8/46)、32.0%(16/50)，肺癌組p-mTOR陽性表達(dá)率明顯高于其余兩組(P均<0.05)。p-mTOR在肺鱗癌、肺腺癌者陽性表達(dá)率分別為71.43%(30/42)、65.0%(26/40)，肺鱗癌、肺腺癌者p-mTOR陽性表達(dá)率均高于其余兩組(P均<0.05)。

肺癌組、肺泡組、支氣管組 p70s6k陽性表達(dá)率分別為85.37%(70/82)、21.74%(10/46)、32.0%(16/50)，肺癌組p70s6k陽性表達(dá)率明顯高于其余兩組(P均<0.05)。p70s6k在肺鱗癌、肺腺癌者的陽性表達(dá)率分別為95.24%(40/42)、87.5%(35/40)，肺鱗癌、肺腺癌者p70s6k陽性表達(dá)率均高于其余兩組(P均<0.05)。

肺癌組、肺泡組、支氣管組PTEN陽性表達(dá)率分別為34.15%(28/82)、71.74%(33/46)、72.0%(36/50)，肺癌組PTEN陽性表達(dá)率明顯低于其余兩組(P均<0.05)。PTEN在肺鱗癌、肺腺癌者的陽性表達(dá)率分別為33.33%(14/42)、35.0%(14/40)，肺鱗癌、肺腺癌者PTEN陽性表達(dá)率均低于其余兩組(P均<0.05)。

p-mTOR、p70s6k及PTEN表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。p-mTOR表達(dá)與NSCLC腫瘤分化程度、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)，PTEN表達(dá)與NSCLC腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)。

表1 p-mTOR、p70s6k及PTEN表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC組織PTEN與p-mTOR、p70s6k陽性表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.38, -0.478；P均<0.01)；p-mTOR、p70s6k陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.311,P<0.01)。

3 討論

mTOR參與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)整、蛋白質(zhì)翻譯起始控制及細(xì)胞凋亡調(diào)整，可加快細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤浸潤、遷移。子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌組織中均發(fā)現(xiàn)mTOR表達(dá)異常升高，其發(fā)生與mTOR信號通路過度活化有關(guān)。p-mTOR能磷酸化下游靶蛋白，其表達(dá)水平能敏感反映mTOR通路的活化狀態(tài)。研究[3]顯示p-mTOR在正常細(xì)胞中表達(dá)陰性或低水平表達(dá)，在惡性腫瘤中呈異常高水平表達(dá)，提示p-mTOR能促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤凋亡，與腫瘤臨床病理特征具有一定相關(guān)性。

p70s6k是p-mTOR下游直接作用底物，其活性升高引起蛋白質(zhì)合成的加速，從而促進(jìn)腫瘤的生成。p-mTOR能磷酸化p70s6k，磷酸化狀態(tài)的p70s6k活性較其前體活性大大增強(qiáng)[3]。p70s6k與消化系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、乳腺癌、血管瘤及腮腺腺癌等腫瘤密切相關(guān)。

具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN是PI3K/Akt/mTOR信號通路的“總開關(guān)”，其脂質(zhì)磷酸酶是其發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵，其功能失活可解除其對腫瘤信號傳導(dǎo)通路的抑制作用，直接參與腫瘤的發(fā)生[4]。PI3K特異性磷酸化細(xì)胞膜的磷脂酰肌醇，生成PIP2、PIP3，其中PIP3在PI3K/Akt/mTOR通路中起信使作用。PTEN蛋白使PIP3去磷酸化形成PIP2，喪失信使功能，阻斷信號通路，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移，起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。研究[5]顯示PTEN基因缺失可刺激PI3K基因超表達(dá)，增強(qiáng)通路活性，降低對凋亡信號敏感性，促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移。

本研究收集NSCLCL標(biāo)本為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，是肺癌的常見病理類型，多數(shù)發(fā)生于支氣管黏膜上皮細(xì)胞，少部分發(fā)生于肺泡上皮細(xì)胞，故設(shè)立支氣管和肺泡正常對照組以提高實(shí)驗(yàn)可靠性。

p-mTOR在乳腺癌、前列腺癌及肝細(xì)胞癌中表達(dá)增高[6]， 發(fā)現(xiàn)肺癌中mTOR基因明顯擴(kuò)增，其蛋白陽性表達(dá)明顯高于良性病變組織，且表達(dá)水平隨腫瘤臨床分期增加而升高，提示mTOR與肺癌發(fā)展有密切關(guān)系。Baba等[7]研究發(fā)現(xiàn)p70s6k高表達(dá)是肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，p70s6k過表達(dá)能促進(jìn)卵巢癌血管生成及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。雷帕霉素抑制大腸癌細(xì)胞增殖并下調(diào)雷帕霉素敏感株的p70s6k表達(dá)水平，提示p70s6k除可以表明通路處于異?；罨癄顟B(tài)，還可以作為雷帕霉素抑制腫瘤細(xì)胞的敏感指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLCL組織中存在p-mTOR、p70s6k高表達(dá)，提示NSCLC中存在p-mTOR/p70s6k信號通路過度激活。分別檢測鱗癌及腺癌組織中兩種蛋白表達(dá)水平，均顯著高于對照組，提示p-mTOR和p70s6k在鱗癌和腺癌發(fā)病過程中存在相似的促癌機(jī)制。本研究結(jié)果顯示與非肺癌病變相比，肺癌中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著下降，提示PTEN缺失、突變及失表達(dá)促進(jìn)NSCLC發(fā)生、發(fā)展。

研究[8，9]發(fā)現(xiàn)，p-mTOR表達(dá)與胃癌及食管癌的分化程度有關(guān)，本研究中，p-mTOR表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)，高分化癌中表達(dá)水平低，隨癌組織向低分化發(fā)展，腫瘤細(xì)胞惡性傾向越明顯，p-mTOR表達(dá)水平越高，提示其促進(jìn)了NSCLC惡性化趨勢。Herberger對NSCLC患者隨訪顯示p-mTOR陽性患者生存期比p-mTOR陰性患者生存期明顯縮短，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，早期肺癌患者組織中p-mTOR蛋白表達(dá)較低，腫瘤分期越晚，p-mTOR蛋白表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差，對判斷NSCLC患者預(yù)后有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，p70s6k表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無關(guān)。但p70s6k在NSCLC中高表達(dá)，反映了mTOR通路活性在癌組織中發(fā)生異常升高，預(yù)示NSCLC患者應(yīng)用雷帕霉素治療可能取得更好療效，有助于選擇患者接受 mTOR抑制劑治療。研究[10～12]顯示在肺癌、食管癌、胰腺癌中mTOR和p70s6k蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論，提示兩指標(biāo)通過同一通路發(fā)揮協(xié)同促癌作用。

本研究中PTEN表達(dá)與腫瘤分化程度及臨床分期相關(guān)，在低分化及晚期癌組織中明顯降低，與以往研究結(jié)果大致相同[13]。腫瘤分化越差，PTEN表達(dá)越低，其機(jī)制可能為PTEN缺失解除了對mTOR通路的抑制作用，通路活性增強(qiáng)，使細(xì)胞呈現(xiàn)無節(jié)制生長，PTEN蛋白丟失越多，細(xì)胞分化程度越差，腫瘤惡性程度越高。PTEN低表達(dá)促進(jìn)肺癌浸潤及轉(zhuǎn)移，其陰性的肺癌患者容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。PTEN隨臨床分期升高而降低，提示其表達(dá)缺失呈加重趨勢，完全失活多出現(xiàn)在晚期，此時(shí)腫瘤更具侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，顯示PTEN缺失預(yù)示著肺癌更具侵襲性而預(yù)后較差，是NSCLC發(fā)展過程的晚期事件，可作為判斷病人預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[14]。

本研究中PTEN與p-mTOR、PTEN與p70s6k表達(dá)水平分別呈負(fù)相關(guān)，說明PTEN缺失導(dǎo)致mTOR信號系統(tǒng)的過度激活[15]，p-mTOR與p70s6k表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者在NSCLC演變過程中起協(xié)同促癌作用。

綜上所述，NSCLC存在p-mTOR、p70s6k高表達(dá)及PTEN低表達(dá)，p-mTOR、p70s6k可能協(xié)同促進(jìn) NSCLC的發(fā)生發(fā)展，PTEN可能在 NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 赫捷,萬青.中國腫瘤登記年報(bào)[M]. 北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2012:28-30.

[2] Petroulakis E, Mamane Y, Le Bacquer O, et al. mTOR signaling:implications for cancer and anticancer therapy[J]. Br J Cancer, 2006,94(2):195-199.

[3] Aoki M, Fujishita T. Oncogenic Roles of the PI3K/AKT/mTOR Axis[J]. Curr Top MicroImmun, 2017,12(5):153-189.

[4] Brandmaier A, Hou SQ, Shen WH. Cell Cycle Control by PTEN[J]. Jour Mol Bio, 2017,429(15):2265-2277.

[5] Gao L，Ren W, Zhang L, et al. PTENp1, a natural sponge of miR-21, mediates PTEN expression to inhibit the proliferation of oral squamous cell carcinoma[J]. Mol Carcinog, 2017,56(4):1322-1334．

[6] Kim EK, Kim JK, Kim HA, et al. Phosphorylated S6 kinase-1: a breast cancer marker predicting resistance to neoadjuvant chemotherapy[J]. Anticancer Res, 2013,33(9):4073-4079.

[7] Baba HA, Wohlschlaeger J, Cicinnati VR, et al. Phosphorylation of p70S6k kinase predicts overall survival in patients with clear marginresected hepatocellular carcinoma[J]. Liver Int, 2009,29(3):399-405.

[8] Shu H, Zhang HL, Xu C, et al. Clinicopathological researchand expression of PTEN/PI3K/Akt signaling pathway in non-small cell lung cancer[J]. Chi Jour Lung Can, 2009,12(8):891-892.

[9] 朱倫,祁昔琴,呂勝祥.p-mTOR、GST-P和K-i67在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相關(guān)性[J].腫瘤防治研究,2010,37(4):428-430.

[10] 王亮,岳文濤,趙曉婷,等.非小細(xì)胞肺癌組織mTOR/P70S6K表達(dá)臨床意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(1):32-35.

[11] 趙有財(cái),李俐,黃悅,等.mTOR信號通路相關(guān)蛋白在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].熱帶病與寄生蟲學(xué),2014,12(1):50-52.

[12] 尹玉慧,張艷,李晟磊,等.mTOR和p-p70s6k在食管鱗癌組織中蛋白表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義[J].世界華人消化雜志,2011,19(23):2450-2454.

[13] Shuang Y, Chen LJ , Daniel W, et al. Protein signatures of molecular pathways in non-small cell lung carcinoma (NSCLC):comparison of glycoproteomics and global proteomics[J]. Clini Pro, 2017, 18(8):526-541.

[14] Li H, Yu ZH, Du YF, et al. Safflower polysaccharide induces NSCLC cell apoptosis by inhibition of the Akt pathway[J]. Oncol Rep, 2016, 36(1):147-154.

[15] Jim M, Suman S, Mohammed A, et al. Withaferin a inhibits prostate carcinogenesis in a PTEN-deficient mouse model of prostate cancer[J]. Neoplasia, 2017, 19(6):451-459.