表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)乙肝病毒復(fù)制的體外抑制作用及其機(jī)制

吳紹鳳，鄭榮榮，司鳳磊，劉宏博，郭文聰，李寧，侯琳

(1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東青島266021；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

乙型肝炎病毒(HBV)感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，我國(guó)是HBV感染大國(guó)。目前臨床上主要采用 α 干擾素 (IFN-α)和核苷類似物進(jìn)行抗病毒治療[1]，核苷類藥物的耐藥性和 IFN-α 的無(wú)應(yīng)答一直是當(dāng)前抗病毒治療的局限所在。尋找干預(yù) HBV 感染和復(fù)制的新靶點(diǎn)和新方法，最大限度的抑制 HBV 復(fù)制，對(duì)阻止乙肝進(jìn)程及并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。綠茶的主要功能成分是茶多酚，以黃烷醇和黃酮醇為主。兒茶素是綠茶中黃酮類的主要成分，其中以表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)含量最多[2]。研究[3]表明EGCG具有抗腫瘤細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞氧化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗菌等作用，且具有神經(jīng)保護(hù)作用。最新研究[4]發(fā)現(xiàn)，EGCG還具有抗病毒活性,如能抗流感病毒、HIV病毒、EB病毒、腺病毒等。EGCG在體外可抑制乙肝病毒復(fù)制[5]，但其具體作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。2016年10月～2017年7月，我們以HepG2.2.15細(xì)胞為模型，觀察了EGCG對(duì)HBV復(fù)制的體外抑制作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、EGCG、試劑及儀器 HepG2.2.15細(xì)胞系購(gòu)自iCell生物公司。HepG2.2.15細(xì)胞給予含15%胎牛血清(Gibco公司)的MEM(Gibco公司)培養(yǎng)基，置于5%的CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。EGCG(南通飛宇生物科技有限公司)，根據(jù)我們前期細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，80 μmol/L以下EGCG對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，因此，我們選擇40、80 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

0.02%胰蛋白酶消化液(碧云天生物有限公司)；MTT試劑盒(索萊寶生物公司)；青鏈霉素混合液(碧云天生物有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(北京全式金生物有限公司)；HBV抗原檢測(cè)ELISA試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)；自噬抑制劑(氯喹CQ、3-MA、Rapamycin)和兔抗LC3多克隆抗體(Sigma公司)；鼠抗β-actin、p62多克隆抗體(SantaCruz公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)；BCA蛋白試劑盒和Protein marker(ThermoFisher公司)；6xProtein loading buffer(北京全式金生物有限公司)。垂直電泳儀、濕法轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；牛血清白蛋白(BSA)(索萊寶生物有限公司)。

1.2 EGCG對(duì)乙肝病毒抗原、DNA的影響觀察

1.2.1 HepG2.2.15細(xì)胞分組及EGCG干預(yù)方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2.2.15細(xì)胞接種于12孔板，將細(xì)胞分為樣本(A、B組)及對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔。A組、B組分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG，對(duì)照組不做任何處理。

1.2.2 各組乙肝病毒抗原檢測(cè) 培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清，用PBS稀釋10倍，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行乙肝病毒e抗原和s抗原的檢測(cè)。分別置于酶標(biāo)儀490、630 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度OD值，按照公式計(jì)算乙肝病毒e抗原和s抗原的相對(duì)表達(dá)量。抗原相對(duì)量=[樣本(OD490-OD630)/空白(OD490-OD630)]×100%。

1.2.3 各組乙肝病毒DNA檢測(cè) 采用real-time PCR法。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清，用Takara公司的迷你病毒DNA提取試劑盒提取上清中病毒DNA。用預(yù)冷的PBS洗兩遍，裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，PH 7.4，1 mmol/LEDTA，1%NP-40)4 ℃旋轉(zhuǎn)裂解15 min，14 000 g離心1 min，取上清，再用細(xì)胞DNA提取試劑盒按說(shuō)明書提取細(xì)胞質(zhì)中乙肝病毒DNA，將提取好的病毒DNA進(jìn)行熒光定量PCR[6]。細(xì)胞總RNA的提取，將同組細(xì)胞按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，取1 μg總DNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行real-time PCR相對(duì)定量。熒光定量PCR反應(yīng)條件為94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)數(shù)。熒光定量PCR的引物序列為乙肝病毒上游引物序列5′-TCTCTGCAATGTCAACGACC-3′,下游引物5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGC -3′；GAPDH上游引物序列5′-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT -3′,下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3′。細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外乙肝病毒DNA的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.3 EGCG對(duì)自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬降解相關(guān)蛋白p62/β-actin的影響觀察 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2.2.15細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞分為1、2、3、4。1、2組分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG，C組加入200 nmol/L的Rapamycin，4組不做任何處理。培養(yǎng)24 h收集各組細(xì)胞，BCA法測(cè)蛋白濃度。20 μg上樣，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，BSA室溫封閉2 h，加入p62、β-actin、LC3一抗(p62 1∶500；β-actin 1∶1 000；LC3 1∶2 500)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL發(fā)光液顯色，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。對(duì)自噬標(biāo)記蛋白LC3和p62以及內(nèi)參蛋白β-actin的條帶進(jìn)行掃描， 凝膠圖象分析各條帶的光密度值。自噬標(biāo)記蛋白LC3有兩個(gè)條帶：游離形式的 LC3-Ⅰ和膜結(jié)合形式的LC3-Ⅰ，常將LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ條帶的光密度比值LC3-Ⅱ/Ⅰ作為自噬發(fā)生的指標(biāo)，其比值越大代表自噬越強(qiáng)；p62與β-actin條帶的光密度比值p62/β-actin作為自噬降解的指標(biāo)，其比值越小代表自噬越強(qiáng)。

1.4 抑制自噬后EGCG對(duì)乙肝病毒乙肝病毒抗原、DNA的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2.2.15細(xì)胞接種于12孔板，將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、自噬抑制組(又分為3-MA組和CQ組)。其中，對(duì)照組、3-MA組、CQ組又各自分為2組。對(duì)照組分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG處理。3-MA組和CQ組分別先用終濃度為10 mmol/L的3-MA和50 μmol/L的CQ預(yù)處理3 h抑制自噬后，再分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG?？瞻捉M不作任何處理。培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞上清，檢測(cè)各組乙肝病毒e抗原、s抗原和乙肝病毒DNA。方法同“1.2”。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)乙肝病毒e抗原、s抗原的影響比較 見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)24 h時(shí)A、B組e抗原、s抗原的相對(duì)量

注：與對(duì)照組比較，#P<0.01。

2.2 EGCG對(duì)乙肝病毒DNA的影響比較 見(jiàn)表2。

表2 A、B組細(xì)胞內(nèi)、外乙肝病毒DNA的相對(duì)表達(dá)量

注：與對(duì)照組比較，#P<0.01。

2.3 EGCG對(duì)自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬降解相關(guān)蛋白p62/β-actin的影響比較 見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞p62/β-actin、LC3-Ⅱ/Ⅰ相對(duì)表達(dá)量比較

注：與4組比較，#P<0.01；與1組比較，＊P<0.01。

2.4 抑制自噬后 EGCG對(duì)乙肝病毒e抗原、s抗原及DNA的影響 見(jiàn)表4。

3 討論

表4 抑制自噬后各組乙肝病毒e抗原、s抗原相對(duì)量及DNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組同濃度比較，#P<0.05。

EGCG由于其抗癌、抗氧化、抗菌、抗病毒等優(yōu)點(diǎn)，研究[4～6]發(fā)現(xiàn)，在恒河猴腎細(xì)胞中，EGCG可干擾病毒黏附從而抑制輪狀病毒和腸病毒；EGCG可通過(guò)與病毒的表面蛋白相互作用抑制單純皰疹病毒黏附到硫酸乙酰肝素，發(fā)揮直接破壞作用,使病毒失活。此外，研究[7]表明，EGCG對(duì)肝炎病毒也有抑制作用，包括HCV和HBV。多項(xiàng)研究[8]表明，EGCG可阻止HCV進(jìn)入細(xì)胞，但對(duì)病毒復(fù)制、RNA合成和病毒顆粒分泌無(wú)影響。目前，EGCG對(duì)HBV的作用研究較少。本研究表明EGCG能有效抑制HBV復(fù)制，降低e抗原和表面抗原的分泌，抑制HBV DNA的表達(dá)，且其抑制率與藥物濃度成量效關(guān)系。

自噬是真核生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的一類降解途徑，通過(guò)形成雙層膜的自噬體，將蛋白質(zhì)等生物大分子或細(xì)胞器(線粒體等)回收至溶酶體將其降解為氨基酸、單糖等小分子，實(shí)現(xiàn)循環(huán)再利用[9～11]。自噬的具體過(guò)程包括：起始、延伸、膜閉合、成熟和細(xì)胞內(nèi)容物的降解。自噬體的膜延長(zhǎng)需要兩類泛素結(jié)合蛋白：ATG12- ATG5-ATG16L1復(fù)合物和LC3蛋白[12]。LC3存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，與酵母的自噬基因Atg8同源，它有游離形式的LC3-Ⅰ和膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ兩種形式。LC3單體的C端剪切加工后產(chǎn)生LC3-Ⅰ，而后與磷脂酰乙醇胺結(jié)合脂化，形成LC3-Ⅱ，被整合到自噬體的內(nèi)外膜上，外膜上的LC3在自噬體與溶酶體融合后脫落，因此LC3常作為檢測(cè)自噬的指標(biāo)。另外，p62蛋白是監(jiān)測(cè)自噬水平的另一指標(biāo)，一方面它靶向泛素化的細(xì)胞器和一些異常蛋白，另一方面它與自噬體內(nèi)膜的LC3蛋白相互作用，將這些異常細(xì)胞器和蛋白包裹進(jìn)自噬體最終送至溶酶體降解，同時(shí)p62也一并被降解，它是自噬降解的特征性底物，其累積量與自噬水平相反。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到致病微生物感染時(shí)，自噬起到一定的防御作用[13～15]。Lee等[16，17]以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)EGCG可通過(guò)誘導(dǎo)Sirt1激活自噬對(duì)人朊蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性發(fā)揮保護(hù)性作用。此外，EGCG在原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞中可抑制人皰疹病毒的復(fù)制，并誘導(dǎo)凋亡和自噬的產(chǎn)生[18，19]。Zhong等[20]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠通過(guò)增強(qiáng)溶酶體酸性加強(qiáng)自噬從而抑制乙肝病毒的復(fù)制。因此，誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬可能成為治療乙肝病毒感染的一種潛在途徑。我們的研究發(fā)現(xiàn)EGCG能夠激活HepG2.2.15細(xì)胞的自噬通量，使LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)增加，p62蛋白的表達(dá)降低，以上這些結(jié)果與Zhong等[20]研究一致，我們推測(cè)EGCG可能通過(guò)激活自噬發(fā)揮抗乙肝病毒作用。

為進(jìn)一步探討EGCG抑制乙肝病毒復(fù)制的機(jī)制，我們將EGCG分別與自噬抑制劑3-MA和氯喹聯(lián)合處理HepG2.2.15細(xì)胞再檢測(cè)其對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用。3-MA主要通過(guò)作用于PI3KC-Ⅲ來(lái)干擾自噬的啟始過(guò)程[21～23]。氯喹則是通過(guò)干擾溶酶體酸化來(lái)抑制自噬通量膜轉(zhuǎn)運(yùn)和底物降解[24，25]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG聯(lián)用自噬抑制劑干預(yù)后，HepG2.2.15細(xì)胞外的HBV DNA的水平較EGCG單處理組明顯升高，HBV表面抗原和e抗原的分泌也均有明顯升高，但相比于空白組仍有降低，說(shuō)明EGCG對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用明顯減弱，且該抑制作用部分依賴于自噬途徑，同時(shí)也說(shuō)明EGCG可能還通過(guò)其他途徑抑制HBV復(fù)制，EGCG還通過(guò)哪些機(jī)制抑制HBV以及如何引發(fā)細(xì)胞自噬發(fā)揮抗乙肝病毒作用，仍需進(jìn)一步探討。

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