CPEB4在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病率和死亡率居所有腫瘤的第一位。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌患者的85%［1］。盡管近些年手術(shù)、放療、化療及靶向藥物在肺癌中的應(yīng)用明顯提高了NSCLC的5年生存率，然而NSCLC遠(yuǎn)期預(yù)后仍很差［2］。目前認(rèn)為NSCLC的發(fā)生發(fā)展涉及一系列分子生物學(xué)的變化，其中有研究證明細(xì)胞翻譯水平變化與NSCLC發(fā)生密切相關(guān)［3］。胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白（cytoplasmic polyade?nylation element binding proteins，CPEB）蛋白家族是具有序列特異性的RNA結(jié)合蛋白，含有RNA識(shí)別基序和鋅指結(jié)構(gòu)。CPEB4是新發(fā)現(xiàn)的CPEB家族成員之一。目前發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)有絲分裂和減數(shù)分裂細(xì)胞周期中起重要的作用［4］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CPEB4與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，血管形成密切相關(guān)。Lu等［5］研究發(fā)現(xiàn)CPEB4在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的CPEB4與低級(jí)別的腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，在腦膜瘤中發(fā)現(xiàn)CPEB4也高表達(dá)，并且表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)［6］。在消化道腫瘤中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在胃癌中CPEB4基因高表達(dá)［7］，直腸癌中相比正常組織，CPEB4基因也高表達(dá)［8］，推測(cè)CPEB4可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因作用。分子機(jī)制方面發(fā)現(xiàn)CPEB4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中受miRNA調(diào)控，進(jìn)而引起下游基因變化［9］，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。然而CPEB4在NSCLC中研究較少，本研究通過檢測(cè)細(xì)胞株及組織中CPEB4 mRNA和蛋白的表達(dá)，并結(jié)合NSCLC患者CPEB4的表達(dá)，探討CPEB4在NSCLC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2007年6月至2012年12月在鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院實(shí)施肺癌根治術(shù)并具有完整臨床病理資料及組織石蠟標(biāo)本的NSCLC 102例患者的隨訪記錄?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)為：1）病理診斷為NSCLC；2）所有患者按照TNM分期（第7版）進(jìn)行診斷，病理診斷分期為Ⅰ～Ⅲa期；3）術(shù)前未接受新輔助放化療及靶向治療；4）病理庫中存有患者腫瘤組織。為研究CPEB4 mRNA和蛋白在腫瘤組織和正常組織之間差別，選取2017年1月到6月10例Ⅰ～Ⅲa期肺癌手術(shù)患者，患者均進(jìn)行了根治性切除；術(shù)后留取腫瘤組織及對(duì)應(yīng)鄰近正常組織標(biāo)本進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)及細(xì)胞株mRNA檢測(cè) NSCLC細(xì)胞株（H322、H1975和A549）和WI-38正常肺細(xì)胞株由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院所提供；培養(yǎng)基為RPMI 1640和10%胎牛血清和青、鏈霉素，細(xì)胞系保持在37℃、5%CO2和95%空氣環(huán)境中。根據(jù)試劑盒進(jìn)行總RNA提取，后進(jìn)行基因的擴(kuò)增。CPEB4引物序列為5′-ACAGTGACTTTGTGATGG ATGG-3'and 5′-TTATCATCGCAAGCTCCACA-3'；βactin：5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3'and 5′-CCAGA GGCGTACAGGGATAG-3'。結(jié)果用ABI PRISM 7500 PCR儀分析，自動(dòng)生成Ct（2-ΔΔCt）值。

1.2.2 Westem blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 總蛋白提取物在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳分離，后轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入原兔抗人CPEB4（美國(guó)Abcam公司），然后對(duì)膜進(jìn)行清洗15 min，3×PBS-T用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔免疫球蛋白抗體（1：2 000）在室溫下60 min。然后用10 min的免疫復(fù)合物PBS-T洗滌3次。利用軟件技術(shù)測(cè)定了凝膠的蛋白條帶的強(qiáng)度。以鹽酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為參照。最后計(jì)算出蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 免疫組織化學(xué)陽性判定 常規(guī)烤片、脫蠟、水化，加入檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%羊血清封閉30 min，CPEB4兔抗人單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）室溫孵育2 h，之后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌，后加入二抗山羊抗兔IgG（美國(guó)Sigma公司）室溫孵育30 min，PBS充分洗滌，流水沖洗后用蘇木素復(fù)染，乙醇、二甲苯脫水，最后封片鏡檢。

免疫組織化學(xué)結(jié)果由2名專業(yè)病理科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，取光學(xué)顯微鏡400倍的視野下進(jìn)行觀察。陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例并記分：＜9%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。按染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色或與背景一致為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。采取染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽性率綜合評(píng)價(jià)染色指數(shù)。陽性細(xì)胞率計(jì)分乘以著色強(qiáng)度評(píng)分≤3分為表達(dá)陰性，＞3分為表達(dá)陽性［6］。

1.2.4 隨訪 術(shù)后定期復(fù)查，第1年每3個(gè)月1次，第2年每6個(gè)月1次，3年以后每年1次，進(jìn)行定期隨訪。隨訪時(shí)進(jìn)行腫瘤標(biāo)記物等檢測(cè)，若懷疑復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步進(jìn)行CT檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)連續(xù)性變量進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，t檢驗(yàn)比較連續(xù)性變量之間的表達(dá)差異，χ2檢驗(yàn)分析蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系，Logistic分析進(jìn)行相關(guān)性多因素分析。Ka?plan-Merier生存分析進(jìn)行單因素分析，Log rank比較組間差異，將單因素有意義的因素納入Cox回歸進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者臨床病理情況

本研究共納入102例NSCLC患者，免疫組織化學(xué)分析顯示CPEB4主要集中于細(xì)胞質(zhì)中（圖1），本研究NSCLC石蠟標(biāo)本中CPEB4陽性表達(dá)39例，陽性表達(dá)率38.2%，患者其他病理資料見表1。

圖1 蘇木素染色后CPEB4在NSCLC組織中的表達(dá)情況

表1 102例NSCLC患者臨床病理基本情況

2.2 CPEB4 mRNA及蛋白的表達(dá)

CPEB4 mRNA在NSCLC細(xì)胞株H322（0.65±0.13）、H1975（0.52±0.14）和A549（0.59±0.21）表達(dá)水平明顯高于WI-38正常肺細(xì)胞株（0.23±0.09），肺癌組織和正常組織比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CPEB4 mRNA在肺癌組織中表達(dá)為（0.54±0.17）高于鄰近正常肺組織（0.26±0.10），肺癌組織和正常組織比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 CPEB4 mRNA在NSCLC細(xì)胞株、NSCLC腫瘤組織以及正常肺細(xì)胞株、正常組織之間的差異

CPEB4蛋白在NSCLC細(xì)胞株H322（1.16±0.22）、H1975（0.97±0.32）和A549（1.13±0.40）表達(dá)明顯高于WI-38正常肺細(xì)胞株（0.57±0.12），肺癌組織和正常組織比較（P＜0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CPEB4蛋白在肺癌組織（1.09±0.26）中表達(dá)高于鄰近正常肺組織（0.54±0.17），肺癌組織和正常組織比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 CPEB4蛋白在NSCLC細(xì)胞株、NSCLC腫瘤組織以及正常肺細(xì)胞株、正常組織之間的表達(dá)差異

2.3 CPEB4蛋白與臨床病理因素的相關(guān)性

χ2相關(guān)分析結(jié)果顯示T分期和N分期與CPEB4表達(dá)密切相關(guān)，Logistic多因素分析發(fā)現(xiàn)N分期HR為1.883，P＜0.05）是CPEB4表達(dá)獨(dú)立相關(guān)因素，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)分期越晚，CPEB4陽性表達(dá)越高（表2）。

2.4 預(yù)后生存分析

本研究預(yù)后單因素分析結(jié)果顯示，性別、年齡、吸煙史、組織類型、腫瘤位置與腫瘤部位與患者預(yù)后無關(guān)（P＞0.05），而T分期（P＜0.05）、N分期（P＜0.001）與CPEB4表達(dá)（P＜0.001）與患者預(yù)后相關(guān)，CPEB4陽性表達(dá)預(yù)后生存差于CPEB4陰性表達(dá)患者（圖4）。將單因素分析有意義的納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示T分期（HR為1.447，P＜0.05）、N分期（HR為1.366，P＜0.05）與CPEB4表達(dá)（HR為1.804，P＜0.05）是患者獨(dú)立預(yù)后因素（表3）。

圖4 NSCLC患者CPEB4表達(dá)的預(yù)后生存分析

表2 102例NSCLC患者CPEB4表達(dá)與臨床病理因素相關(guān)性分析

表3 NSCLC患者預(yù)后生存分析

3 討論

CPEB家族包含4個(gè)成員，所有的CPEB蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)，羧基端相對(duì)保守，而氨基末端高度變異［4］。目前研究發(fā)現(xiàn)CPEBs與生殖細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞分裂與衰老、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)與記憶等密切相關(guān)［10］。CPEB4是新發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白家族成員之一。CPEB4與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)CPEB4與mRNA轉(zhuǎn)錄及翻譯密切相關(guān)，CPEB4激活mRNA過程并影響翻譯，導(dǎo)致下游因子如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件、細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)分子、及細(xì)胞遷移相關(guān)基因等，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展［11］。Chang等［12］研究發(fā)現(xiàn)CPEB4與接頭蛋白相互作用，影響JNK信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移。CPEB4與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，CPEB4在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且CPEB4表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤大小和顱內(nèi)高壓征等腫瘤特性密切相關(guān)［13］。田偉峰等［7］發(fā)現(xiàn)CPEB4基因在胃癌組織中高表達(dá)，腫瘤大小、腫瘤部位和T分期與CPEB4表達(dá)相關(guān)。Tsai等［14］發(fā)現(xiàn)CPEB4在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲除CPEB4抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。預(yù)后生存方面，Hansen等［15］研究發(fā)現(xiàn)CPEB4高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后獨(dú)立因素，臨床上可檢測(cè)CPEB4表達(dá)預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后。同樣在胃癌中，CPEB4表達(dá)也為預(yù)后獨(dú)立因素。

本研究進(jìn)一步結(jié)合NSCLC患者臨床病理資料，研究CPEB4與臨床病理因素之間的相關(guān)性及探討其在預(yù)后中的價(jià)值。首先發(fā)現(xiàn)NSCLC細(xì)胞株CPEB4 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于正常肺細(xì)胞株，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NSCLC腫瘤組織中CPEB4 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于鄰近正常組織，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CPEB4表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)分期越晚，CPEB4陽性表達(dá)越高。根據(jù)這些結(jié)果，推測(cè)CPEB4可能與NSCLC發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，可能作為癌基因發(fā)揮作用。與Tsai等［14］研究相一致，發(fā)現(xiàn)CPEB4與MMP-2和MMP-9密切相關(guān)，結(jié)合之前研究推測(cè)CPEB4與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而本研究尚未就CPEB4對(duì)侵襲方面具體機(jī)制方面進(jìn)行探討，將來通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步研究CPEB4具體機(jī)制。生存發(fā)現(xiàn)CPEB4表達(dá)陽性患者預(yù)后差于CPEB4表達(dá)陰性患者。預(yù)后多因素分析發(fā)現(xiàn)CPEB4表達(dá)為患者獨(dú)立預(yù)后因素，表明CPEB4高表達(dá)患者可能為預(yù)后高危人群，CPEB4可作為NSCLC預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CPEB4在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，CPEB4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CPEB4為預(yù)后獨(dú)立因素，為NSCLC治療提供潛在靶點(diǎn)。

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