鮮豬肉中沙門氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力模型的建立與驗(yàn)證

殷玉潔， 倪培恩， 劉丹蕾， 張菊梅， 吳清平， 王大鵬,*

(1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 食品科學(xué)與工程系, 上海 200240；2.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510070)

沙門氏菌(Salmonella)是主要的食源性致病菌之一。據(jù)報(bào)道，全球每年因該菌感染導(dǎo)致約9.38億例腹瀉病例，約有15萬(wàn)人死于由非傷寒沙門氏菌引起的疾病[1]。在我國(guó)，70%～80%的細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門氏菌感染引發(fā)的[2]。豬肉是中國(guó)人餐桌上常見(jiàn)食材，也是食源性致病細(xì)菌生長(zhǎng)的溫床，市售新鮮豬肉的沙門氏菌檢出率高達(dá)38.0%以上[3-5]。市售新鮮豬肉中所污染沙門氏菌的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律尚不清楚，政府管理部門很難對(duì)其進(jìn)行有效防控。

食品中沙門氏菌的種類和豐度對(duì)該菌的消長(zhǎng)有影響[6]。目前，關(guān)于沙門氏菌生長(zhǎng)模型的研究主要采用單一菌種進(jìn)行人工污染，故難以準(zhǔn)確反映出豬肉中細(xì)菌的實(shí)際生長(zhǎng)狀況[7-8]。環(huán)境因素是影響豬肉中沙門氏菌等致病細(xì)菌消長(zhǎng)的重要影響因子之一，其中，溫度變化是影響沙門氏菌生長(zhǎng)的主要因素[9]。此外，沙門氏菌為適應(yīng)溫度的變化往往會(huì)表現(xiàn)出一系列反應(yīng)[6,9]。本團(tuán)隊(duì)對(duì)上海市市售農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌污染情況的調(diào)查結(jié)果顯示，豬肉中以腸炎沙門氏菌 (SalmonellaEnteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌 (SalmonellaTyphimurium)和德爾卑沙門氏菌(SalmonellaDerby)3種血清型為主[10]；因此，本研究擬以這3種血清型沙門氏菌作為研究對(duì)象，人工污染新鮮豬肉，利用預(yù)測(cè)微生物學(xué)中的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型建立不同恒溫條件下沙門氏菌的生長(zhǎng)模型，并驗(yàn)證其有效性，為政府監(jiān)管部門防控沙門氏菌的污染提供理論支撐，降低因該菌污染所引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豬肉(里脊肉)，購(gòu)于上海市閔行區(qū)某大型超市；Luria-Bertani(LB)液/固體培養(yǎng)基，購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌生理鹽水：稱取9.0 g的氯化鈉(NaCl)，以少量去離子水充分溶解后，定容至1 000 mL。分裝后，進(jìn)行121 ℃滅菌(15 min)。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3780型高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；AES Chemunex型均質(zhì)機(jī)，法國(guó)Marcy- L’etoile公司；超純水機(jī)，美國(guó)Milli-Q公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；微波爐，韓國(guó)LG公司；電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；MS-2型渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；HP-9272型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZ-8211K型恒溫?fù)u床，太倉(cāng)市科教儀器廠；LRH-150F型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Whirl-Park?型無(wú)菌均質(zhì)袋，深圳Nasco公司；MIR-154型培養(yǎng)箱，日本SANYO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌株活化

用無(wú)菌接種環(huán)分別蘸取適量甘油冷凍管凍存的不同血清型沙門氏菌[10]，LB平板上劃線后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)10～12 h。

1.3.2菌懸液的制備

取不同菌株的LB培養(yǎng)液，調(diào)整OD600為0.6，等比例混合。用無(wú)菌生理鹽水將混合菌液梯度稀釋，最終制成濃度為103～104CFU/mL的菌懸液，以備后續(xù)接種使用。

1.3.3樣品制備

從超市購(gòu)置新鮮豬里脊肉，在冷藏(0～4 ℃)條件下于1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。將豬肉置于紫外燈下滅菌30 min，用無(wú)菌手術(shù)刀將豬肉均勻分塊，每塊25.0 g，厚度3.0～5.0 mm。

1.3.4接種

將1.3.3制備的肉塊置于1.3.2中所制備的菌懸液中室溫浸泡20 min，瀝干肉塊多余水分。將肉塊分別放入不同的無(wú)菌保鮮盒(每個(gè)保鮮盒中放有一個(gè)無(wú)菌不銹鋼架，防止肉塊在恒溫放置過(guò)程中與產(chǎn)生的肉汁接觸而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)中并分別置于4、10、25、33、37 ℃培養(yǎng)箱，每組3份，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5沙門氏菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將1.3.4中的人工污染豬肉樣品分別置于5個(gè)設(shè)定溫度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間，每組分別取出3份25.0 g平行樣品，分別置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無(wú)菌生理鹽水，均質(zhì)機(jī)拍打3 min。用無(wú)菌生理鹽水對(duì)處理樣品的混合液進(jìn)行10倍梯度稀釋。取3個(gè)適宜梯度的稀釋液(1.0 mL)涂布于LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日計(jì)數(shù)。具體方法參照GB 4789.2—2016[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均由Origin Pro 2017以及DMfit 3.5軟件進(jìn)行分析。

1.4.1沙門氏菌初級(jí)模型建立

基于修正的Gompertz模型，利用DMfit 3.5軟件將沙門氏菌在不同溫度下生長(zhǎng)量的變化情況進(jìn)行曲線擬合，得到沙門氏菌的初級(jí)生長(zhǎng)模型。

修正的Gompertz模型方程見(jiàn)式(1)。

(1)

式(1)中：t是培養(yǎng)時(shí)間，h；N(t)是t時(shí)的微生物數(shù)量，CFU/g；N0是t=0時(shí)的初始微生物數(shù)量，CFU/g；Nmax表示生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)的最大微生物數(shù)量，CFU/g；μmax表示微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率，h-1；λ表示微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的延滯期，h。

1.4.2溫度對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)影響二級(jí)模型的建立

由1.4.1建立的初級(jí)模型得到μmax和λ等參數(shù)，根據(jù)參數(shù)建立沙門氏菌的二級(jí)生長(zhǎng)模型。二級(jí)生長(zhǎng)模型以初級(jí)模型為基礎(chǔ)，主要用于描述初級(jí)模型的參數(shù)(如λ、μmax等)與不同的環(huán)境參數(shù)(如溫度、水分活度、pH值等)之間的關(guān)系。本研究主要著重于溫度對(duì)初級(jí)模型參數(shù)(μmax和λ)的影響，利用平方根模型描述溫度與μmax和溫度與λ之間的變化關(guān)系。具體模型如式(2)和式(3)。

(2)

(3)

式(2)和式(3)中：T表示培養(yǎng)溫度，℃；Tmin表示最低生長(zhǎng)溫度，℃；bμmax和bλ分別是兩個(gè)方程的常數(shù)。

1.4.3沙門氏菌生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證

1.4.3.1 模型的內(nèi)部驗(yàn)證

生長(zhǎng)模型的內(nèi)部驗(yàn)證主要基于各項(xiàng)數(shù)學(xué)參數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中主要利用Af、Bf、均方根誤差(RMSE)、判定系數(shù)(R2)以及殘差分析對(duì)模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證。Af(見(jiàn)式(4))表示預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值之間的準(zhǔn)確程度，如果Af>1，并且值越接近1，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值越接近，該模型具有較高的準(zhǔn)確度[12]。Bf(見(jiàn)式(5))表示預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值之間的偏差程度，若Bf<1，表示預(yù)測(cè)值比觀測(cè)值小，表示該模型的預(yù)測(cè)值處于一個(gè)合理的范圍內(nèi)[12]。RMSE(見(jiàn)式(6))可以用來(lái)衡量預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)值的離散程度[12]。

(4)

(5)

(6)

在式(4)、式(5)中，μpre表示根據(jù)生長(zhǎng)模型得到的微生物數(shù)量的預(yù)測(cè)值；μobs表示在相同時(shí)間，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中所觀察到的微生物數(shù)量；n表示實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

R2用來(lái)對(duì)模型方程的擬合優(yōu)度進(jìn)行評(píng)價(jià)，如果R2越接近1，則表示該模型的擬合優(yōu)度越高。殘差分析指觀測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的差，即實(shí)際觀察值與模型預(yù)測(cè)值的差，并以此來(lái)分析模型的可靠性。

1.4.3.2 模型的外部驗(yàn)證

選取20 ℃和28 ℃作為額外的驗(yàn)證溫度，在相同環(huán)境下對(duì)沙門氏菌進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，對(duì)已建立的模型進(jìn)行可靠性評(píng)估。實(shí)驗(yàn)步驟同1.3。

1.4.4波動(dòng)溫度下沙門氏菌生長(zhǎng)模型的建立

模擬日常生活中消費(fèi)者購(gòu)買冷藏的新鮮豬肉，帶回家，再冷藏的過(guò)程。以4 ℃ 6 h，20 ℃ 3 h和4 ℃ 90 h作為波動(dòng)溫度條件，建立沙門氏菌在鮮豬肉中的生長(zhǎng)模型。以等效生長(zhǎng)時(shí)間理論為基礎(chǔ)，用修正的Gompertz模型可以較好地描述波動(dòng)溫度下微生物的生長(zhǎng)過(guò)程。當(dāng)微生物在T1溫度下培養(yǎng)時(shí)間t1，該階段可用方程表示，見(jiàn)式(7)。

(7)

當(dāng)微生物在溫度T1下培養(yǎng)時(shí)間t1后，又進(jìn)入溫度T2培養(yǎng)時(shí)間t2時(shí)，根據(jù)EGT原理，T1溫度下培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)t1的過(guò)程，等效于在T2溫度時(shí)培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)te的生長(zhǎng)過(guò)程，可用方程表示，見(jiàn)式(8)。

(8)

將λ1、λ2、μ1、μ2代入式(7)和式(8)后，可以得到te值。在溫度T1培養(yǎng)t1后，溫度波動(dòng)至溫度T2，這一過(guò)程可以用式(9)表述，其中Δt表示在溫度T2時(shí)培養(yǎng)的時(shí)間。

(9)

1.4.5波動(dòng)溫度下沙門氏菌生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證

在波動(dòng)溫度下，該模型可靠性可以用Af、Bf等參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)；但Af和Bf不再根據(jù)μmax進(jìn)行計(jì)算，而是把同一時(shí)間點(diǎn)上觀測(cè)得到的細(xì)菌量和模型預(yù)測(cè)得到的細(xì)菌量進(jìn)行比較，再計(jì)算得到Af和Bf。波動(dòng)溫度下Af和Bf的計(jì)算公式見(jiàn)式(10)、式(11)。

(10)

(11)

2 結(jié)果與分析

2.1 市售新鮮豬肉中沙門氏菌初級(jí)生長(zhǎng)模型分析

對(duì)在5個(gè)恒定溫度下人工污染豬肉樣品中的沙門氏菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，利用修正的Gompertz方程對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到沙門氏菌在豬肉中的生長(zhǎng)曲線(圖1)。圖1顯示，沙門氏菌在不同溫度下生長(zhǎng)曲線均能形成良好的“S”型，且溫度對(duì)其生長(zhǎng)影響較大。限定溫度范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度越高，細(xì)菌生長(zhǎng)速率越高。當(dāng)環(huán)境溫度控制在10 ℃以下時(shí)，可以有效限制沙門氏菌生長(zhǎng)。研究結(jié)果提示：為了較好地降低沙門氏菌的污染風(fēng)險(xiǎn)，需要盡早將食品低溫保存。

圖1 新鮮豬肉中沙門氏菌在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Salmonella at different temperatures in fresh pork

沙門氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力模型參數(shù)分析見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，不同培養(yǎng)溫度下，各初級(jí)生長(zhǎng)模型的判定系數(shù)R2均大于0.99，證明修正的Gompertz模型可以較好地反映出新鮮豬肉中沙門氏菌的生長(zhǎng)規(guī)律。沙門氏菌的μmax和λ與溫度關(guān)系密切，沙門氏菌的μmax隨溫度的升高而升高。當(dāng)溫度在4 ℃時(shí)，沙門氏菌的μmax為0.017 28，生長(zhǎng)十分緩慢；當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，該菌μmax為0.818 5，遠(yuǎn)高于4 ℃時(shí)的μmax。沙門氏菌的λ隨著溫度的升高而不斷減小。當(dāng)溫度在4 ℃時(shí)，λ為77.471 9；當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，λ僅為2.279 5。溫度對(duì)于沙門氏菌的最終濃度也有一定影響，25、33、37 ℃時(shí)的最終濃度均能達(dá)到108CFU/g以上，而在4 ℃和10 ℃這兩個(gè)較低溫度下，其最終濃度均低于108CFU/g。此結(jié)果與鄭婷等[7]研究結(jié)果相吻合，其在冷卻牛肉中沙門氏菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立研究中，同樣證實(shí)生長(zhǎng)速率與遲滯期對(duì)溫度都具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

表1 不同溫度下沙門氏菌的生長(zhǎng)參數(shù)Tab.1 Growth parameters of Salmonella at different temperatures

2.2 沙門氏菌二級(jí)模型分析與驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1二級(jí)模型分析

圖2 溫度與μmax的關(guān)系Fig.2 Fitted curve of the maximum specific growth rate and temperature

圖3 溫度與λ的關(guān)系Fig.3 Fitted curve of lag phase and temperature

2.2.2沙門氏菌生長(zhǎng)模型驗(yàn)證結(jié)果分析

圖4 沙門氏菌生長(zhǎng)速率平方根模型的殘差Fig.4 Residual error of Salmonella growth rate model

2)外部驗(yàn)證結(jié)果分析。根據(jù)在20 ℃和28 ℃兩個(gè)溫度下的額外實(shí)驗(yàn)所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)已經(jīng)建立的溫度與μmax的關(guān)系進(jìn)行二級(jí)模型的驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)表2。

Te Giffel等[14]認(rèn)為，Bf值在0.75～1.25時(shí)，該模型可信度較高，可以被接受。Braun等[15]認(rèn)為，Af值在1.1～1.9時(shí)，生長(zhǎng)模型可被接受。由表2可知，外部驗(yàn)證溫度為20 ℃和28 ℃時(shí)，Bf分別為0.936 9和0.846 3，Af為1.174 6和1.181 6，均在可接受的范圍內(nèi)。

表2 模型外部驗(yàn)證中Af和BfTab.2 Af and Bf of external validation of model

2.3 波動(dòng)溫度下沙門氏菌生長(zhǎng)模型分析與驗(yàn)證結(jié)果

在利用修正的Gompertz模型建立沙門氏菌初級(jí)生長(zhǎng)模型的基礎(chǔ)上，根據(jù)平方根模型，建立沙門氏菌的二級(jí)模型，見(jiàn)式(12)、式(13)。

(12)

(13)

在波動(dòng)溫度為4 ℃ 6 h，20 ℃ 3 h，4 ℃ 90 h的條件下，以恒定溫度下建立的二級(jí)模型為基礎(chǔ)，根據(jù)等效生長(zhǎng)理論建立波動(dòng)溫度下沙門氏菌的生長(zhǎng)模型。對(duì)新鮮豬肉中沙門氏菌在該條件下的實(shí)際生長(zhǎng)狀況進(jìn)行定量測(cè)定。通過(guò)比較實(shí)測(cè)值與模型的預(yù)測(cè)值，評(píng)估該模型的可靠性，模型的建立與驗(yàn)證見(jiàn)圖5。從圖5結(jié)果中可以看出，實(shí)測(cè)值的分布趨勢(shì)與模型曲線的趨勢(shì)基本一致，且都落在預(yù)測(cè)曲線附近，表明建立的預(yù)測(cè)模型與沙門氏菌實(shí)際生長(zhǎng)情況較為吻合。隨溫度升高至20 ℃，沙門氏菌的濃度有一個(gè)明顯的上升趨勢(shì)，說(shuō)明溫度的升高明顯加快了沙門氏菌的生長(zhǎng)，所以消費(fèi)者在購(gòu)買完豬肉后應(yīng)及時(shí)將豬肉帶回家，盡早烹飪或置于低溫貯存。通過(guò)該預(yù)測(cè)模型還可以發(fā)現(xiàn)，在100 h內(nèi)，沙門氏菌在波動(dòng)溫度下的生長(zhǎng)量一直保持在103.8CFU/g以下，說(shuō)明消費(fèi)者從購(gòu)買豬肉開始，再到將豬肉放在冰箱保存的4 d內(nèi)，在低溫條件下，沙門氏菌的生長(zhǎng)量不大。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，豬肉的表面也未出現(xiàn)明顯的腐敗現(xiàn)象，無(wú)異味產(chǎn)生，這也驗(yàn)證了豬肉在該波動(dòng)溫度下微生物生長(zhǎng)速度緩慢。

圖5 波動(dòng)溫度下沙門氏菌濃度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值Fig.5 Observed values and predicted curves of Salmonella grown in pork at fluctuating temperature

圖6表示在波動(dòng)溫度下，同一時(shí)間點(diǎn)沙門氏菌生長(zhǎng)量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性。其中R2=0.944，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)性較高。

圖6 波動(dòng)溫度下同一時(shí)間點(diǎn)沙門氏菌濃度實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性比較Fig.6 Observed values and predicted values under variable temperatures

本實(shí)驗(yàn)利用Af和Bf對(duì)波動(dòng)溫度下所建立的沙門氏菌生長(zhǎng)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，Af=1.136 2，誤差在15%內(nèi)，屬于文獻(xiàn)[14-15]得到的可接受范圍；該模型的Bf=0.895 4，同樣在文獻(xiàn)[14-15]得到的可接受的范圍內(nèi)。因此，在波動(dòng)溫度下建立的生長(zhǎng)模型在預(yù)測(cè)沙門氏菌生長(zhǎng)狀況方面可靠性較高。

表3 波動(dòng)溫度下沙門氏菌生長(zhǎng)模型的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)Tab.3 Af and Bf of predictive model at fluctuating temperatures

3 結(jié) 論

選取具有代表我國(guó)居民日常肉類膳食的市售新鮮豬肉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將前期研究中得到的豬肉中檢出率最高、分布最廣的3種血清型沙門氏菌混合物對(duì)豬肉進(jìn)行人工污染。分別測(cè)定了4、10、25、33、37 ℃五個(gè)恒定溫度下細(xì)菌的生長(zhǎng)規(guī)律，建立了市售新鮮豬肉中沙門氏菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型并利用DMfit 3.5軟件進(jìn)行擬合分析。

1)所得5個(gè)恒定溫度下沙門氏菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，R2均大于0.99，模型擬合程度高，結(jié)果可靠；μmax和λ分別隨溫度的升高而增大和縮短。在初級(jí)模型基礎(chǔ)上建立了沙門氏菌的二級(jí)模型，該模型能夠準(zhǔn)確地反映出溫度與μmax和λ間的關(guān)系，殘差絕對(duì)值均小于0.05，在置信水平α= 0.05上可信。用20 ℃和28 ℃對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，其Bf分別為0.936 9和0.846 3，Af為1.174 6和1.181 6，均在可接受的范圍內(nèi)，表明該模型能有效預(yù)測(cè)豬肉中沙門氏菌的生長(zhǎng)狀況。

2)基于等效時(shí)間理論建立的波動(dòng)溫度下沙門氏菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，實(shí)測(cè)值的分布趨勢(shì)與模型曲線的趨勢(shì)基本一致。同一時(shí)間點(diǎn)沙門氏菌生長(zhǎng)量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的R2=0.944，模型擬合良好。利用Af和Bf對(duì)波動(dòng)溫度下所建立的生長(zhǎng)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，Af=1.136 2，Bf=0.895 4，表明波動(dòng)溫度下建立的生長(zhǎng)模型在預(yù)測(cè)沙門氏菌生長(zhǎng)狀況方面可靠性較高。

3)研究結(jié)果提示，消費(fèi)者在購(gòu)買豬肉后應(yīng)盡快食用或放在低溫環(huán)境下保存，以降低因沙門氏菌增殖而增加的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

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