基于美拉德反應(yīng)的酶改性大豆蛋白凍融穩(wěn)定性研究

王喜波 于 潔 王小丹 陳 爽 崔 強(qiáng) 江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白因具有兩親結(jié)構(gòu)常被當(dāng)做乳化劑應(yīng)用在食品加工領(lǐng)域[1]。為了延長(zhǎng)保質(zhì)期和維持最佳口感，許多食品需要通過(guò)冷凍技術(shù)來(lái)保存。然而，蛋白乳化體系對(duì)環(huán)境變化極為敏感[2]，在冷凍過(guò)程中，乳液界面膜上的蛋白相互作用力減弱，尖銳的冰晶極易刺破界面膜破壞乳液的油- 水平衡，使乳液出現(xiàn)乳析、聚結(jié)、絮凝和奧氏熟化等不穩(wěn)定現(xiàn)象[3]，嚴(yán)重限制了大豆分離蛋白在植脂奶油及冷凍食品中的應(yīng)用。因此，對(duì)蛋白進(jìn)行改性處理以提高其功能性質(zhì)非常必要。

酶改性和美拉德反應(yīng)是兩種常用的蛋白改性方法。許多研究表明，蛋白經(jīng)過(guò)酶法改性后會(huì)暴露出更多的疏水基團(tuán)[4]，同時(shí)增加分子的柔性[5]，提高大豆蛋白的功能性質(zhì)[6]。美拉德反應(yīng)是一種安全有效的蛋白改性方法，改性蛋白能夠快速吸附至油水界面增加界面膜的厚度[7]，糖鏈的引入增加了油滴之間空間位阻的排斥力[8]，提高蛋白的凍融穩(wěn)定性。近幾年，酶改性聯(lián)合美拉德反應(yīng)對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性處理已成為研究的熱點(diǎn)。ZHANG等[9]發(fā)現(xiàn)單純的酶解可以使大豆分離蛋白的抗氧化性得到提升，而大豆分離蛋白水解物與麥芽糊精反應(yīng)后，其抗氧化性進(jìn)一步得到提高。WAITER等[10]研究了限制性酶解和美拉德反應(yīng)聯(lián)合作用對(duì)大豆蛋白免疫反應(yīng)性的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白水解度為7.8%時(shí)，與多糖的共聚物可以有效降低大豆蛋白的免疫反應(yīng)性。然而，目前關(guān)于酶改性聯(lián)合美拉德反應(yīng)提高乳液凍融穩(wěn)定性的研究還未見報(bào)道。

本文利用胰蛋白酶對(duì)SPI(大豆分離蛋白)酶解處理得到不同水解度的SPH(大豆分離蛋白水解物)，隨后與葡聚糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成SPI- D(大豆分離蛋白- 葡聚糖)和SPH- D(大豆分離蛋白水解物- 葡聚糖)。通過(guò)接枝度、褐變指數(shù)、內(nèi)源熒光光譜、粒徑大小、聚結(jié)程度和出油率來(lái)評(píng)價(jià)改性蛋白的凍融穩(wěn)定性，選擇出最優(yōu)酶解體系，隨后利用激光共聚焦顯微鏡觀察最優(yōu)酶解體系的微觀結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探究提高SPI凍融穩(wěn)定性的方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白，采用堿溶酸沉法[11]提取，凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.96%；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；葡聚糖(右旋糖酐分子質(zhì)量40 Ku)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；九三大豆油，市售；其他試劑均為分析純。

T18 Basic型高速分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；AVP- 2000型高壓均質(zhì)機(jī)，英國(guó)Stansted Fluid Power公司；F- 4500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；TU- 1800型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Master Sizer 2000型激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern公司；TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1大豆分離蛋白水解物的制備

根據(jù)前期試驗(yàn)，用磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L, pH值8.0)將SPI配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶，在37℃恒溫水浴鍋中分別反應(yīng)15、120、200、255、300 min后，于90℃水浴滅活10 min，冷卻至室溫(20℃)后凍干，得到水解度分別為1%、2%、3%、4%和5%的SPH。

1.2.2SPI- D和SPH- D接枝物的制備

將SPI(SPH)和葡聚糖按1∶1溶于磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L, pH值7.0)，蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，并添加質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的疊氮鈉以防止微生物滋生。將混勻的樣品液密封后置于95℃水浴鍋中反應(yīng)1.5 h，取出，冷卻至室溫，凍干。

1.2.3乳液制備

用磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L, pH值7.0)將SPI- D和SPH- D配制成質(zhì)量濃度2 mg/mL的樣品液，加入體積分?jǐn)?shù)10%的大豆油，在10 800 r/min條件下均質(zhì)處理1 min形成初乳液，然后以40 MPa的壓力高壓均質(zhì)處理，一次得到SPI- D乳液和SPH- D乳液。

1.2.4凍融循環(huán)

將不同樣品乳液立即轉(zhuǎn)移到25 mL的具塞試管中，-20℃冷凍儲(chǔ)存22 h后，在25℃水浴中解凍2 h，取部分樣品進(jìn)行試驗(yàn)分析，如此循環(huán)3次。

1.2.5接枝度和褐變指數(shù)測(cè)定

將SPI- D和SPH- D以2 mg/mL的質(zhì)量濃度溶于去離子水中。取200 μL樣品溶液加入到4 mL OPA(鄰苯二甲醛)試劑中，混勻后35℃水浴保溫反應(yīng)2 min，以O(shè)PA試劑做空白，在340 nm紫外波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，接枝反應(yīng)前后吸光度的變化率即為接枝度。OPA試劑按照王喜波等[12]的方法配制。以去離子水做空白對(duì)照，在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)得SPI- D和SPH- D樣品溶液的吸光度即為其褐變指數(shù)。

1.2.6內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

用磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L, pH值7.0)將SPI、SPI- D和SPH- D配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣品溶液，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)347 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍375～550 nm進(jìn)行掃描[13]。然后將上述樣品溶液稀釋20倍使其質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍300～400 nm進(jìn)行掃描。激發(fā)和發(fā)射狹縫為5.0 nm，掃描速度240 nm/min。

1.2.7粒徑測(cè)定

利用Master Sizer 2000型激光粒度分析儀測(cè)定乳液的平均粒徑，設(shè)置分散相折射率分別為1.460和0.001，連續(xù)相折射率為1.330[14]。將初始乳液和經(jīng)過(guò)凍融循環(huán)后的乳液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS(十二烷基硫酸鈉)稀釋5倍后，分散在去離子水中使遮光度達(dá)到10%，測(cè)定其體積平均粒徑D4,3。

1.2.8聚結(jié)程度測(cè)定

聚結(jié)是乳液中油滴分子之間經(jīng)過(guò)接觸合并形成大油滴的過(guò)程。聚結(jié)程度計(jì)算公式為

(1)

式中D4,3f——凍融后乳液的體積平均粒徑

D4,3i——初始乳液的體積平均粒徑

參考PAIANUWECH等[15]的方法略加改動(dòng)。稱取0.015 g蘇丹Ⅲ試劑加入到1 000 g大豆油中，室溫?cái)嚢?2 h得到蘇丹Ⅲ油溶液。準(zhǔn)確稱取4 g蘇丹Ⅲ油溶液和16 g待測(cè)乳液于50 mL離心管中，振蕩混勻，以16 000g(4℃)的離心力離心20 min，收集上層油液于508 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)以大豆油做空白。出油率計(jì)算公式為

(2)

式中m0——蘇丹Ⅲ油溶液的質(zhì)量

me——乳液的質(zhì)量

a——蘇丹Ⅲ油溶液吸光度與離心后蘇丹Ⅲ油溶液吸光度的比值

φd——乳液中油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

1.2.10激光共聚焦顯微鏡分析

老巴慌成一團(tuán)。他急不擇路地沖過(guò)去，蹲下身來(lái)扶老婆。慌亂中自己憑著一條腿怎么都站不起身。手臂下老婆的氣息越來(lái)越弱。老巴慌了，聲嘶力竭地叫喚，有如荒野中絕望的狼。隔壁左右聽到這聲音，嚇得不輕，都急急奔來(lái)。

取1 mL樣品乳液于試管中，加入40 μL尼羅紅染料和40 μL尼羅藍(lán)染料，充分振蕩混勻5 min。取10 μL染色后的樣品乳液滴加到載玻片中央，蓋上蓋玻片后分別在488 nm和633 nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行激光共聚焦掃描，油鏡進(jìn)行圖像采集，紅色代表油滴，綠色代表蛋白質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，使用Origin 8.6軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白樣品接枝度和褐變指數(shù)分析

研究表明，美拉德反應(yīng)程度越高，褐變程度越大，且蛋白的美拉德反應(yīng)程度與蛋白水解程度密切相關(guān)[9]。圖1中SPH1- D～SPH5- D表示水解度分別為1%～5%的大豆分離蛋白水解物與葡聚糖的接枝物。由圖1可以看出，隨著水解程度的增加，接枝度和褐變指數(shù)均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。在水解度為2%時(shí)，接枝度與褐變指數(shù)最低，分別為6.32%和0.524，可能是由于酶解和美拉德反應(yīng)共同作用導(dǎo)致改性產(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[16]。當(dāng)水解度達(dá)到4%時(shí)，SPH- D的接枝度明顯高于SPI- D的接枝度，這是因?yàn)槊附馐沟鞍捉Y(jié)構(gòu)展開，柔性增加，暴露出更多的賴氨酸殘基，更易與葡聚糖發(fā)生反應(yīng)[17]。此外，胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)以及不同亞基的酶解過(guò)程不同步等因素都會(huì)影響蛋白與葡聚糖的美拉德反應(yīng)。另外，SPI- D褐變指數(shù)明顯高于SPH- D，這可能是由SPI比SPH分子量更大導(dǎo)致的[18]。

圖1 不同蛋白樣品的接枝度和褐變指數(shù)Fig.1 Grafting degree and browning index of different protein samples注：不同字母表示不同樣品之間差異顯著，下同。

2.2 不同蛋白樣品內(nèi)源熒光光譜分析

熒光物質(zhì)是美拉德反應(yīng)高級(jí)階段的小分子物質(zhì)，可靈敏地反映其早期過(guò)程。固定激發(fā)波長(zhǎng)347 nm，掃描得到的熒光光譜如圖2a所示，其熒光強(qiáng)度表征了高級(jí)階段熒光物質(zhì)的產(chǎn)生狀態(tài)。SPI在發(fā)射波長(zhǎng)為450.0 nm處有最大熒光強(qiáng)度，而SPI- D和SPH- D在發(fā)射波長(zhǎng)439.4～443.4 nm之間有最大熒光強(qiáng)度，最大熒光強(qiáng)度發(fā)生了藍(lán)移(即向短波方向移動(dòng))且明顯高于SPI，說(shuō)明有美拉德反應(yīng)的特征熒光小分子物質(zhì)生成。BENJAKUL等[19]和LERTITTIKUL等[20]研究發(fā)現(xiàn)，豬血漿蛋白的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度明顯高于豬血漿蛋白，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 不同蛋白樣品的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of different protein samples

大豆分離蛋白中的色氨酸殘基有很強(qiáng)的熒光性，對(duì)微觀環(huán)境的變化非常敏感，因此能夠靈敏地反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[21]。固定激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，掃描不同樣品的熒光光譜如圖2b所示。大豆分離蛋白經(jīng)過(guò)酶解和美拉德反應(yīng)之后，其內(nèi)源熒光光譜的最大熒光強(qiáng)度發(fā)生了紅移(即向長(zhǎng)波方向移動(dòng))，說(shuō)明糖基化反應(yīng)會(huì)改變蛋白質(zhì)色氨酸殘基的周圍環(huán)境，使其所處環(huán)境極性增加[22]，CORZOMARTINEZ等[23]在β-乳球蛋白- 半乳糖糖基化改性的研究中也得到相似的結(jié)果，共價(jià)復(fù)合物的最大熒光強(qiáng)度在糖基化反應(yīng)后發(fā)生紅移，表明色氨酸殘基向更加親水的環(huán)境中暴露。同時(shí)可以明顯看出SPH- D相較于SPI- D紅移程度更大，說(shuō)明酶解能使大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)展開，被包埋在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的色氨酸基團(tuán)暴露，增加其表面疏水性[24]。而糖基化后的蛋白熒光強(qiáng)度降低，推測(cè)是大豆分離蛋白與糖結(jié)合后，取代了大豆分離蛋白表面分子的原因[25]。

2.3 不同蛋白乳液平均粒徑分析

一般來(lái)說(shuō)，蛋白乳液的液滴平均粒徑越小，乳液越穩(wěn)定[26]。凍融循環(huán)對(duì)乳液液滴平均粒徑的影響如圖3所示。在凍融循環(huán)之前，SPI- D初始乳液的粒徑為(1.37±0.02) μm，經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后，SPI- D乳液粒徑分別為(1.7±0.11) μm、(3.67±0.21) μm和(4.48±0.24) μm。由此發(fā)現(xiàn)SPI- D乳液在凍融循環(huán)后粒徑明顯增加，單純的蛋白和多糖在短時(shí)間內(nèi)不能充分反應(yīng)生成足夠多的大分子復(fù)合物，在油滴周圍形成的界面層并不十分緊密，小油滴很容易從界面層滲透出來(lái)接觸聚結(jié)成大油滴，破壞乳液的凍融穩(wěn)定性[27]。研究表明，大豆分離蛋白在酶解后會(huì)暴露出更多的疏水基團(tuán)并生成一些具有良好界面活性的多肽[28]，因此SPH- D乳液經(jīng)3次凍融循環(huán)后粒徑尺寸增加程度較小，相比于SPI- D乳液更加穩(wěn)定。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)SPH3- D乳液的粒徑明顯小于其他樣品乳液，經(jīng)3次凍融循環(huán)后其粒徑比SPI- D降低了48.28%，說(shuō)明SPH3- D乳液的凍融穩(wěn)定性最好。另外，雖然圖1中SPH1- D和SPH2- D的接枝度均低于SPI- D，但它們的粒徑明顯比SPI- D小，暗示了在酶解聯(lián)合糖基化反應(yīng)體系中，糖基化程度的高低并不能完全代表凍融穩(wěn)定性的強(qiáng)弱。

圖3 凍融后不同蛋白乳液的體積平均粒徑Fig.3 Volume average partical size of different protein emulsions after freeze-thaw cycles

2.4 不同蛋白乳液聚結(jié)程度和出油率分析

經(jīng)過(guò)凍融處理后，乳液界面膜變得不穩(wěn)定，油滴之間容易聚結(jié)。乳液的凍融循環(huán)次數(shù)越多，其聚結(jié)程度越大。不同乳液經(jīng)凍融循環(huán)后的聚結(jié)程度變化如圖4所示，由于酶解能夠把大分子量的蛋白切成分子量相對(duì)較小的肽片段從而改變其柔性和空間結(jié)構(gòu)[29]，更易與多糖結(jié)合形成致密的界面膜，可以有效抑制油滴聚集，因此SPH- D樣品的聚結(jié)程度明顯低于SPI- D。隨著水解度的增大，乳液的聚結(jié)程度整體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)水解度為3%時(shí)，乳液每次凍融循環(huán)后的聚結(jié)程度都低于其他樣品乳液，分別為5.47%、38.09%和41.24%，比SPI- D的聚結(jié)程度分別降低了89.85%、68.96%和81.61%。這可能是因?yàn)檫m度的酶解能暴露蛋白的疏水基團(tuán)，使其更易吸附在油滴表面抵抗冷凍對(duì)乳液穩(wěn)定性的破壞，然而過(guò)度酶解會(huì)生成過(guò)多的小分子片段，降低多肽在界面膜中的相互作用，導(dǎo)致乳液中的油滴結(jié)晶刺破較薄的界面膜，發(fā)生聚結(jié)[24]。

不同蛋白乳液的出油率與聚結(jié)程度有相似的變化規(guī)律(圖5)，糖鏈的引入以及適度的酶解作用使SPH- D共價(jià)復(fù)合物具有較好的乳化性，在油水體系中能夠迅速地在油滴表面形成相對(duì)較厚的界面膜，抑制油滴之間聚合[30]。ZHANG等[31]利用超聲和微波輔助糖基化提高SPI- D乳液的凍融穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后，乳液出油率在9%左右，而從圖5可以看出，SPH- D乳液的出油率明顯低于9%。由此進(jìn)一步說(shuō)明酶改性聯(lián)合美拉德反應(yīng)可以明顯提高大豆分離蛋白的凍融穩(wěn)定性。當(dāng)水解度為3%時(shí)，3次凍融循環(huán)后乳液出油率比SPI- D降低了63.81%，凍融穩(wěn)定性最好。

圖4 凍融后不同蛋白樣品的聚結(jié)程度Fig.4 Coalescence degree of different protein emulsions after freeze-thaw cycles

圖5 凍融后不同蛋白樣品的出油率Fig.5 Oil production rate of different protein emulsions after freeze-thaw cycles

2.5 不同蛋白乳液激光共聚焦顯微鏡分析

通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)SPI- D(圖6a、6c)和SPH3- D(圖6b、6d)的初始乳液和經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后乳液的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白樣品初始乳液的液滴分布均勻一致，油滴尺寸細(xì)小，微觀結(jié)構(gòu)并沒有明顯區(qū)別。SPI- D乳液經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后出現(xiàn)較為明顯的蛋白聚集現(xiàn)象，部分小油滴聚結(jié)成大油滴，油滴表面幾乎觀察不到綠色的蛋白界面膜，但仍然有很多小油滴被緊密地包裹在界面膜內(nèi)，說(shuō)明單純的美拉德反應(yīng)對(duì)提高乳液的凍融穩(wěn)定性是有一定作用的，這與孫洪蕊等[8]的觀點(diǎn)一致。而SPH3- D乳液在3次凍融循環(huán)之后油滴尺寸略有增大，蛋白之間只出現(xiàn)輕微的橋聯(lián)絮凝現(xiàn)象，表現(xiàn)出較高的凍融穩(wěn)定性。LI等[32]探究了大豆分離蛋白水解物的美拉德反應(yīng)并觀察其微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大豆肽- 葡聚糖共聚物具有極高的乳化穩(wěn)定性，能夠形成較厚的吸附層防止液滴的聚集和絮凝，與本試驗(yàn)結(jié)果十分吻合。這是因?yàn)檫m度的酶解能降低蛋白中球形分子的數(shù)量，提高蛋白質(zhì)的分子柔性，使得蛋白質(zhì)分子在油水界面上的排列更為有序[33-34]，形成具有良好抗應(yīng)變能力的界面膜，提高了乳液凍融穩(wěn)定性。這與乳液平均粒徑、聚結(jié)程度和出油率的測(cè)定結(jié)果一致。

3 結(jié)論

(1)基于美拉德反應(yīng)的酶改性作用可以顯著提高大豆分離蛋白的凍融穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后，SPH- D乳液的凍融穩(wěn)定性明顯高于SPI- D乳液，當(dāng)水解度為3%時(shí)，SPH3- D乳液的粒徑尺寸、聚結(jié)程度和出油率分別比SPI- D乳液降低了48.28%、81.61%和63.81%。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)SPI- D乳液和SPH3- D乳液微觀結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)單純的美拉德反應(yīng)對(duì)提高乳液的凍融穩(wěn)定性是有積極作用的。SPH3- D乳液在3次凍融循環(huán)后蛋白沒有明顯的橋聯(lián)絮凝現(xiàn)象，油滴依然被緊密地包裹在界面膜中，表現(xiàn)出較好的凍融穩(wěn)定性。

圖6 SPI- D和SPH3- D凍融前后的激光共聚焦顯微結(jié)構(gòu)Fig.6 Confocal laser scanning microscopies of SPI- D and SPH3- D emulsions after three freeze-thaw cycles

(2)酶改性能使蛋白暴露出更多的疏水基團(tuán)并產(chǎn)生一些具有良好界面活性的多肽，有效改善蛋白的界面性質(zhì)，多糖的空間位阻效應(yīng)能增加油滴之間的排斥力，同時(shí)美拉德反應(yīng)引入的糖鏈?zhǔn)沟鞍姿馕镄纬捎H水基團(tuán)，從而提高乳液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

1 WAGNER J R, GUEGUEN J. Surface functional properties of native, acid-treated, and reduced soy glycinin. 2. Emulsifying properties[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1999, 47(6): 2181-2187.

2 KIM H J, DECKER E A, MCCLEMENTS D J. Impact of protein surface denaturation on droplet flocculation in hexadecane oil-in-water emulsions stabilized by beta-lactoglobulin[J]. Journal Agricultural & Food Chemistry, 2002, 50(24): 7131-7137.

3 MAGNUSSON E, ROSEN C, NILSSON L. Freeze-thaw stability of mayonnaise type oil-in-water emulsions[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(4): 707-715.

4 BATTAGLINO R A, HUERGO M, PILOSOF A M R, et al. Culture requirements for the production of protease byAspergillusoryzae, in solid state fermentation[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 1991, 35(3): 292-296.

5 趙新淮, 侯瑤. 大豆蛋白限制性酶解對(duì)乳化性質(zhì)和吸油性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2009, 40(12): 159-163.

ZHAO Xinhuai, HOU Yao. Limited hydrolysis of soybean proteins and modifications in emulsifying property and oil absorption capacity[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2009, 40(12): 159-163. (in Chinese)

6 MARTINEZ K D, FARIAS M E, AMR P. Effects of soy protein hydrolysis and polysaccharides addition on foaming properties studied by cluster analysis[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(7): 1667-1676.

7 DIFITS N G, BILIADERIS C G, KIOSSEOGLOU V D. Rheological properties and stability of model salad dressing emulsions prepared with a dry-heated soybean protein isolate-dextran mixture[J]. Food Hydrocolloids, 2005, 19(6): 1025-1031.

8 孫洪蕊, 張英華, 王喜波, 等. 提高大豆蛋白凍融后乳化性改性工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2014, 30(7): 281-286.

SUN Hongrui, ZHANG Yinghua, WANG Xibo, et al. Processing optimization for improving soybean protein’s emulsifying properties after freeze-thaw[J]. Transactions of the CSAE, 2014, 30(7): 281-286. (in Chinese)

9 ZHANG Y, TAN C, ZHANG X, et al. Effects of maltodextrin glycosylation following limited enzymatic hydrolysis on the functional and conformational properties of soybean protein isolate[J]. European Food Research & Technology, 2014, 238(6): 957-968.

10 WALTER J, GREENBERG Y, SRIRAMARAO P, et al. Limited hydrolysis combined with controlled Maillard-induced glycation does not reduce immunoreactivity of soy protein for all sera tested[J]. Food Chemistry, 2016, 213: 742-752.

11 SORGENTINI D A, WAGNER J R, ANON M C. Effects of thermal treatment of soy protein isolate on the characteristics and structure-function relationship of soluble and insoluble fractions[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1995, 43(9): 2471-2479.

12 王喜波, 張澤宇, 葛洪如,等. 超聲輔助制備抗凍融大豆分離蛋白工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2016, 32(14): 272-278.

WANG Xibo, ZHANG Zeyu, GE Hongru, et al. Processing optimization for improving freeze-thaw stability of soybean protein isolate by ultrasonic assisted glycosylation[J]. Transactions of the CSAE, 2016， 32(14): 272-278. (in Chinese)

13 MORALES F J, JIMENEZ P S. Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence[J]. Food Chemistry, 2001, 72(1): 119-125.

14 ZHAO L, MOUMING Z, NING L, et al. Physicochemical properties of peanut oil-based diacylglycerol and their derived oil-in-water emulsions stabilized by sodium caseinate[J]. Food Chemistry, 2015, 184: 105-113.

15 PAIANUWECH J, POTINENI R, RROBERTS R F, et al. A method to determine free fat in emulsions[J]. Food Hydrocolloids, 2003, 17(1): 55-62.

16 ZHANG B, GUO X, ZHU K, et al. Improvement of emulsifying properties of oat protein isolate-dextran conjugates by glycation[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 127: 168-175.

17 IPSEN R, OTTE J, SHARMA R, et al. Effect of limited hydrolysis on the interfacial rheology and foaming properties of beta-lactoglobulin A[J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2001, 21(1-3): 173-178.

18 NOOSHKAM M, MADADLOU A. Microwave-assisted isomerisation of lactose to lactulose and Maillard conjugation of lactulose and lactose with whey proteins and peptides[J]. Food Chemistry, 2016, 200: 1-9.

19 BENJAKUL S, LERTITTIKUL W, BAUER F. Antioxidant activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-sugar model[J]. Food Chemistry, 2005, 93(2): 189-196.

20 LERTITTIKUL W, BENJAKUL S, TANAKA M. Characteristics and antioxidative activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-glucose model system as influenced by pH[J]. Food Chemistry, 2007, 100(2): 669-677.

21 MATIACEVICH S B, BUERA M P. A critical evaluation of fluorescence as a potential marker for the Maillard reaction[J]. Food Chemistry, 2006, 95(3): 423-430.

22 SPONTON O E, PEREZ A A, CARRARA C R, et al. Impact of environment conditions on physicochemical characteristics of ovalbumin heat-induced nanoparticles and on their ability to bind PUFAs[J]. Food Hydrocolloids, 2015, 48: 165-173.

23 CORZOMARTINEZ M, JAVIER M F, VILLAMIEL M, et al. Characterization and improvement of rheological properties of sodium caseinate glycated with galactose, lactose and dextran[J]. Food Hydrocolloids, 2010, 24(1): 88-97.

24 STANCIUC N, APRODU I, IONITA E, et al. Exploring the process-structure-function relationship of horseradish peroxidase through investigation of pH- and heat induced conformational changes[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2015, 147: 43-50.

25 XIA S, LI Y, ZHAO Q, et al. Probing conformational change of bovine serum albumin-dextran conjugates under controlled dry heating[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2015, 63(16): 4080-4086.

26 MCCLEMENTS D J. Critical review of techniques and methodologies for characterization of emulsion stability[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 2007, 47(7): 611-649.

27 GU Y S, DECKER E A, MCCLEMENTS D J. Formation of colloidosomes by adsorption of small charged oil droplets onto the surface of large oppositely charged oil droplets[J]. Food Hydrocolloids, 2007, 21(4): 516-526.

28 沙小梅, 胡姿姿, 涂宗財(cái),等. 高壓微射流壓力對(duì)大豆蛋白- 大豆多糖體系功能性質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2016, 32(17): 281-286.

SHA Xiaomei, HU Zizi, TU Zongcai, et al. Effect of dynamic high-pressure microfluidization on functional properties of soy protein isolate-soybean soluble polysaccharides system[J]. Transactions of the CSAE, 2016, 32(17): 281-286. (in Chinese)

29 CHOBERT J M, SITOHY M, WHITAKER J R. Specific limited hydrolysis and phosphorylation of food proteins for improvement of functional and nutritional properties[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1987, 64(12): 1704-1711.

30 NOOSHKAM M, MADADLOU A, MADADLOU A. Microwave-assisted isomerisation of lactose to lactulose and Maillard conjugation of lactulose and lactose with whey proteins and peptides[J]. Food Chemistry, 2016, 200: 1-9.

31 ZHANG Z, WANG X, YU J, et al. Freeze-thaw stability of oil-in-water emulsions stabilized by soy protein isolate-dextran conjugates[J]. LWT—Food Science and Technology, 2017, 78: 241-249.

32 LI W, ZHAO H, HE Z, et al. Modification of soy protein hydrolysates by Maillard reaction: effects of carbohydrate chain length on structural and interfacial properties[J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2016, 138: 70-77.

33 王喜波, 王健, 張澤宇,等. 物理改性對(duì)大豆蛋白柔性與乳化性的影響及其相關(guān)性分析[J/OL]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2017, 48(7): 339-344. http:∥www. j-csam. org/jcsam/ch/reader/view_abstract. aspx?flag=1&file_no=20170743&journal_id=jcsam. DOI:10.6041/j.issn.1000-1298.2017.07.043.

WANG Xibo, WANG Jian, ZHANG Zeyu, et al. Effect of physical modification on flexibility and emulsifying property of soy protein and its correlation analysis[J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2017, 48(7): 339-344. (in Chinese)

34 TANG C H, SHEN L. Role of conformational flexibility in the emulsifying properties of bovine serum albumin[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2013, 61(12): 3097-3110.