復(fù)合酶制備抗氧化活性核桃多肽工藝優(yōu)化

王攀 范娜

摘 要：以堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶復(fù)合水解核桃蛋白制備抗氧化活性多肽的工藝條件優(yōu)化為對象，通過研究酶解時間、酶解溫度、酶與底物濃度比及復(fù)合酶比例對核桃蛋白酶解物清除DPPH·能力的影響，并利用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，以提高核桃蛋白多肽對DPPH·的清除率。結(jié)果表明，酶解時間、酶解溫度、酶與底物濃度比及復(fù)合酶比例對核桃蛋白酶解物清除DPPH·能力有一定影響；當(dāng)木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)合酶解溫度為45℃、時間1.5h、酶與底物濃度1500U/g、pH值7.0、復(fù)合酶比例為2∶1時，酶解物清除DPPH·的能力最強(qiáng)，清除率達(dá)78.7%。

關(guān)鍵詞：核桃多肽；復(fù)合酶；工藝優(yōu)化

中圖分類號 TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）08-0022-03

核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，富含18種氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量高[1]，其酶解產(chǎn)物核桃蛋白多肽具有濃度高、溶解性好等特性[2-3]，乳化性、吸濕性等均優(yōu)于核桃蛋白，更適合用于加工生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)食品[4]。在食品加工中，脂肪的氧化是影響食品風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和外觀的主要因素[5]，具有抗氧化活性的生物活性肽是潛在的天然、安全、高效的抗氧化劑[6-7]。酶的水解和微生物的發(fā)酵是較常用的水解蛋白質(zhì)的方式[8-9]。核桃蛋白水解后具有很好的抗氧化、抑菌、抗腫瘤等作用[10]，因此利用核桃蛋白開發(fā)具有抗氧化活性的多肽市場前景廣闊。本實(shí)驗(yàn)通過利用木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)合水解核桃蛋白，研究其復(fù)合比例、水解條件對水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，以提升核桃蛋白水解物的抗氧化活性，為核桃蛋白多肽的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 材料：核桃，市售；木瓜蛋白酶（1000U/mg）；堿性蛋白酶（10000U/g）；DPPH（D9132）。試劑：無水乙醇，乙醚，鹽酸等均為分析純。

1.1.2 設(shè)備 LGJ-100型真空冷凍干燥機(jī)：北京四科學(xué)儀器廠有限公司；SW-CJ-1F型通風(fēng)櫥：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；H-2050R型離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；7230G型紫外分光光度儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TP-214型電子天平：北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司；JMS-125Q型膠體磨：廊坊市惠友機(jī)械有限公司；JB-2A型恒溫磁力攪拌器：上海雷磁新涇儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃蛋白制備 核桃去殼、去皮（0.5mol/L氫氧化鈉溶液在60℃以下加熱3min），迅速投入1.0%檸檬酸溶液中冷卻，撈出瀝干水分，用膠體磨進(jìn)行勻漿，隨后將核桃漿與乙醚充分混合，靜置20h，去除醚層，并在通風(fēng)櫥中將乙醚揮發(fā)完全，然后用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9.0，攪拌1h后離心（5000r/min，15min），取上清液，用0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5，攪拌1h后離心（5000r/min，15min），取沉淀，水洗至中性[19]。最后進(jìn)行冷凍干燥，得到核桃餅粕蛋白粉[11-12]。

1.2.2 核桃餅粕蛋白多肽液的制備 配置5%的核桃餅粕蛋白液，在60℃水浴鍋中保溫30min，調(diào)整pH為7.0，將木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶以1：1的比例混合，并以酶與底物濃度之比為1000U/g加入，調(diào)節(jié)酶解溫度為45℃，酶解1h，沸水浴滅酶10min，冷卻后在4000r/min下離心20min，取上清液，即得到核桃餅粕多肽溶液[13]。

1.2.3 酶解條件對核桃餅粕蛋白多肽液抗氧化活性的影響 按照1.2.2的方法酶解核桃蛋白，分別單一改變其中復(fù)合酶比例（木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶比例至1∶3、1∶2、

1∶1、2∶1、3∶1）、復(fù)合酶添加量（500U/g、750U/g、1000U/g、1500U/g、2000U/g）、酶解時間（0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h）、酶解溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）條件，考察核桃餅粕蛋白多肽液的對二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除率。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對DPPH·清除率影響較大的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化工藝參數(shù)。

1.3 樣品中DPPH·清除率的測定 核桃蛋白肽對二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除能力的測定[1][20]。取多肽樣液2mL及0.2mmol/L DPPH·溶液（用無水乙醇配制）2mL加入同一試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30min，于517nm波長下測定吸光度[14-16]。

[DPPH清除率%=1-（A1-A0）A2×100]

式中：A0為樣液+無水乙醇溶液的吸光度；A1為樣液+DPPH·溶液的吸光度；A2為DPPH·溶液+無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶比例對核桃多肽抗氧化活性的影響 由圖1可知，復(fù)合酶的比例對核桃多肽清除DPPH·的能力有顯著影響。隨木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶的比例的降低，核桃多肽清除DPPH·的能力呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，當(dāng)木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶的比例為1∶1時，核桃多肽的清除率最高，達(dá)到59.3%。由于兩種酶作用于蛋白不同的肽鍵位點(diǎn)，導(dǎo)致酶解產(chǎn)生的多肽分子量大小和生物活性存在差異，當(dāng)酶復(fù)合配比變化時，酶解得到的多肽發(fā)生變化，可能當(dāng)木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶比例為1∶1時酶解得到的具有抗氧化活性的多肽較多，故其清除率較高。

2.1.2 復(fù)合酶添加量對核桃多肽抗氧化活性的影響 由圖2可知，復(fù)合酶添加量對核桃多肽清除DPPH·的能力有一定影響。當(dāng)復(fù)合酶添加量小于1000U/g時，核桃多肽清除DPPH·的能力隨添加量的增大而增強(qiáng)；當(dāng)復(fù)合酶添加量大于1000U/g時，核桃多肽清除DPPH·的能力隨復(fù)合酶添加量的增大變化不大，主要是因?yàn)楫?dāng)酶的添加量較大時，底物蛋白質(zhì)的相對濃度較小，基本已被酶飽和，部分酶分子將不能充分與蛋白質(zhì)分子結(jié)合[17-18]，導(dǎo)致酶的添加量超過一定量后，其對核桃多肽的抗氧化性影響不大。

2.1.3 復(fù)合酶酶解溫度對核桃多肽抗氧化活性影響 由圖3可知，酶解溫度對于核桃多肽清除DPPH·的能力有一定影響。隨酶解溫度的升高，核桃多肽清除DPPH·的能力呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)酶解溫度低于45℃時，核桃多肽清除DPPH·的能力隨酶解溫度的升高明顯增強(qiáng)；當(dāng)酶解溫度高于45℃時，核桃多肽清除DPPH·的能力呈現(xiàn)微弱的下降趨勢。這是因?yàn)闇囟壤^續(xù)上升使得酶變性，酶活力減弱[19]，且底物蛋白也受到溫度影響，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。

2.1.4 復(fù)合酶酶解時間對核桃蛋白抗氧化活性影響 由圖4可知，酶解時間對核桃多肽清除DPPH·的能力有較大影響。當(dāng)酶解時間低于1h時，隨酶解時間的延長，核桃多肽清除DPPH·的能力迅速升高；當(dāng)酶解時間大于1h時，核桃多肽清除DPPH·的能力逐漸降低；可能由于酶解反應(yīng)開始的前一段時間，由于酶促反應(yīng)的底物濃度較好，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，隨酶解時間的延長，底物濃度逐漸降低，酶解反應(yīng)逐漸減弱，同時酶解產(chǎn)物暴露在空氣中使得其抗氧化性也受到一定影響。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的的基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、酶解時間、復(fù)合酶添加量及配比為因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，影響核桃多肽清除DPPH·能力的主次因素為D>C>B>A，即復(fù)合酶配比>添加量>酶解時間>酶解溫度；且最優(yōu)水平組合為A2B2C3D1，即酶解溫度為45℃，酶解時間為1.5h復(fù)合酶添加量為1500U/g，木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶之比為2∶1，核桃多肽的DPPH·清除率最高，達(dá)到78.7%。

3 結(jié)論

（1）當(dāng)利用木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)合酶解核桃蛋白制備核桃多肽時，酶解時間、酶解溫度、pH、復(fù)合酶添加量、復(fù)合酶比例對核桃多肽DPPH·清除率有一定的影響作用。

（2）利用木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)合酶解核桃蛋白時，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解時間為1.5h，復(fù)合酶添加量為1500U/g，酶解pH為7.0，復(fù)合酶比例為2∶1時，酶解制備的核桃多肽DPPH·清除率最高，達(dá)到了78.7%。

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（責(zé)編：王慧晴）