雙功能石墨烯量子點(diǎn)的制備及在pH熒光檢測和細(xì)胞成像中的應(yīng)用

嚴(yán)平 李在均

摘 要 為改善石墨烯量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)，設(shè)計(jì)并合成了五乙烯六胺和十二胺功能化石墨烯量子點(diǎn)（PEHA-GQD-DA）。將檸檬酸和五乙烯六胺混合，170℃熱解0.5 h后加入十二胺，繼續(xù)反應(yīng)1.5 h得到PEHA-GQD-DA。PEHA-GQD-DA由尺寸僅為1～3 nm的石墨烯片組成，片邊緣含有豐富的功能基團(tuán)。五乙烯六胺的引入顯著提高了量子點(diǎn)的熒光發(fā)射，熒光量子產(chǎn)率達(dá)到72.7%，明顯高于單獨(dú)檸檬酸熱解所制備的石墨烯量子點(diǎn)。引入十二胺，使PEHA-GQD-DA容易通過細(xì)胞膜磷脂雙分子層進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。PEHA-GQD-DA對環(huán)境pH值表現(xiàn)出極佳的光學(xué)響應(yīng)行為。在pH 1.0～6.5時(shí)，熒光強(qiáng)度隨pH值增加而線性增強(qiáng)。隨pH值的變化，熒光光譜也發(fā)生改變，最大發(fā)射波長與pH值之間存在良好的線性關(guān)系。在pH 6.5～12.0時(shí)，熒光光譜不再隨pH值變化而變化，但熒光強(qiáng)度隨pH值增大而線性減少。常見無機(jī)離子和小分子化合物不影響PEHA-GQD-DA對pH值的熒光響應(yīng)。PEHA-GQD-DA已成功應(yīng)用于環(huán)境水樣pH值的熒光檢測和Hela細(xì)胞成像。

關(guān)鍵詞 雙功能石墨烯量子點(diǎn)；光學(xué)性能；pH探針；生物成像

1 引 言

pH值對細(xì)胞代謝、增殖、吞噬作用、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等生命過程影響都有一定影響[1]。pH值的微小變化可能引發(fā)系列生命現(xiàn)象改變，因此，監(jiān)測pH值變化是探索細(xì)胞功能和了解細(xì)胞內(nèi)化的重要途徑[2]。pH值異常變化可能造成細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、炎癥、缺血性中風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、囊性纖維化、癲癇發(fā)作以及心肺和神經(jīng)退行性疾病[3]。血液pH值<7.35，屬于酸中毒，是需要治療的嚴(yán)重疾病。酸中毒多為某種疾病并發(fā)癥[4]。代謝性酸中毒可由腹膜炎、休克、高熱、腸瘺、急性腎衰竭等引起[5]，而呼吸性酸中毒則是由腦膜炎、血栓、脊髓灰質(zhì)炎、支氣管哮喘以及廣泛性肺疾病引起[6]。血液pH值>7.45，屬于堿中毒，也是需要治療的嚴(yán)重疾病[7]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞正常生理?xiàng)l件下的外液略呈堿性，在腫瘤形成情況下，pH值較正常值偏低[8]。因此，精確測定pH值具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

測定pH值常用pH響應(yīng)電極、傳感器和試紙。pH電極和傳感器在使用中存在一些限制，包括需要參比電極和頻繁的校準(zhǔn)、對電活性成分敏感以及信號不穩(wěn)定[9]。pH試劑使用方便，但測定精度不高。上述方法都不適合細(xì)胞內(nèi)pH值的測定。近年來， 對pH值響應(yīng)的有機(jī)[10]和無機(jī)發(fā)光材料[11]引起廣泛關(guān)注。主要的發(fā)光材料有半導(dǎo)體量子點(diǎn)[12]、金屬納米簇[13]、非金屬納米簇[14]、碳量子點(diǎn)[15] 和石墨烯量子點(diǎn)[16]。不同于傳統(tǒng)方法，光學(xué)探針法是一種非接觸式方法，更適合細(xì)胞水平上的pH值監(jiān)測。此外，熒光探針法還具有操作簡單、檢測快速和靈敏高等特點(diǎn)。然而，現(xiàn)有光學(xué)材料在生物相容性性、發(fā)光效率和通過細(xì)胞膜磷脂雙分子層的能力方面仍不理想。

石墨烯量子點(diǎn)是一種準(zhǔn)零維的納米材料，尺寸僅有幾納米，具有顯著的量子局限效應(yīng)和獨(dú)特的光電性能[17，18]。相比于半導(dǎo)體量子點(diǎn)，石墨烯量子點(diǎn)具有更好的生物相容性、發(fā)光強(qiáng)度、光穩(wěn)定性和環(huán)境友好性[19]。目前，石墨烯量子點(diǎn)已應(yīng)用于太陽能電池[20]、光學(xué)器件[21]、生物標(biāo)記[22]、細(xì)胞成像[23]、電化學(xué)傳感器[24]、超級電容[25]和鋰離子電池[26]等方面。為進(jìn)一步改善pH值光學(xué)響應(yīng)，本研究設(shè)計(jì)合成五乙烯六胺（PEHA）和十二胺（DA）雙功能化石墨烯量子點(diǎn)（PEHA-GQD-DA）。PEHA-GQD-DA具有優(yōu)異的光學(xué)性能，并被用于水樣pH值熒光檢測和Hela細(xì)胞成像。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Cary Esclipse熒光光度計(jì)（美國瓦里安公司）； JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）； Nicolet iS50 FT-IR傅立葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）； S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立株式會(huì)社）； TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

檸檬酸（CA）、五乙烯六胺（PEHA）、十二胺（DA）、NaOH、H3PO4、乙酸和H3BO3（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）。BR緩沖溶液：將0.04 mol/L H3PO4、乙酸和H3BO3混合，加入不同體積的0.02 mol/L NaOH，得到不同pH值的BR緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 PEHA-GQD-DA制備

在25 mL燒杯中，加入4.2 g一水檸檬酸，用5 mL水溶解，邊攪拌邊滴加1.86 g PEHA。將燒杯轉(zhuǎn)移至烘箱中，于100℃下加熱除去游離水，升溫至150℃并保溫0.5 h，然后降溫至100℃。在劇烈攪拌下加入15 μL DA，升溫至160℃，繼續(xù)反應(yīng)1.5 h，冷卻至室溫。將得到的PEHA-GQD-DA配制成0.05 mg/L的溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 7，用0.22 μm濾膜過濾，在截留分子量3 kDa的透析袋中透析24 h，得量子點(diǎn)儲備液，4℃保存，備用。

2.3 熒光檢測

將200 μL PEHA-GQD-DA工作液（0.05 mg/L）轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，依次加入200 μL水（或環(huán)境水樣）和600 μL BR緩沖溶液（pH 7.0），搖勻，以360 nm為激發(fā)波長，測量熒光光譜或熒光強(qiáng)度。

2.4 細(xì)胞成像

將Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。成像實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至共聚焦專用培養(yǎng)皿，培養(yǎng)6 h，用5 mL PBS緩沖溶液（pH 7.4）洗滌3次。加入20 μg/mL PEHA-GQD-DA溶液，于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)4 h，用5 mL PBS緩沖溶液（pH 7.4）洗滌3次， 去除殘余量子點(diǎn)，選擇490 nm激發(fā)光，在共聚焦熒光顯微鏡上進(jìn)行熒光成像。

3 結(jié)果與討論

3.1 PEHA-GQD-DA制備

PEHA-GQD-DA制備包括二步熱解反應(yīng)，如圖1所示。首先，以檸檬酸和PEHA混合物為碳源熱解形成PEHA-GQD。然后，PEHA-GQD再與DA縮合得到PEHA-GQD-DA。檸檬酸主要是通過分子間脫水及隨后的碳化過程形成由sp2碳原子組成的石墨烯片[27]。PEHA和DA都是功能性試劑，通過分子中的氨基與檸檬酸分子中的羧基縮合將功能基團(tuán)引入到石墨烯片的邊緣，實(shí)現(xiàn)石墨烯量子點(diǎn)的功能化。PEHA分子中有6個(gè)氮原子，它的強(qiáng)供電子作用顯著增加了石墨烯片的電荷密度，從而提高了石墨烯量子點(diǎn)的熒光發(fā)射性能。此外，PEHA分子中的NH和NH2基團(tuán)可通過在不同酸度下的質(zhì)子化和離解改變石墨烯片的電學(xué)特征，使石墨烯量子點(diǎn)能對介質(zhì)pH值改變產(chǎn)生靈敏的光學(xué)響應(yīng)。盡管DA也能產(chǎn)生供電子效應(yīng)，對石墨烯量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)起到一定作用，但它的主要功能是在石墨烯片邊緣引入疏水性烷基鏈。烷基鏈的引入使PEHA-GQD-DA具有典型的雙親結(jié)構(gòu)，以有利于量子點(diǎn)通過細(xì)胞膜磷脂雙分子層而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。另一方面，檸檬酸、PEHA和DA都是化學(xué)活性化合物，在加熱條件下，同種分子或不同分子之間可縮合形成多種碳納米材料，這可能直接影響到產(chǎn)物純度和光學(xué)性能。然而，兩步熱解法可較好地解決這一問題。在室溫下，在第一步反應(yīng)中，檸檬酸與PEHA通過酸堿反應(yīng)形成鹽； 然后，在高溫下，熱解形成PEHA-GQD。由于150℃的反應(yīng)溫度超過了檸檬酸分子縮合和碳化以及檸檬酸中羧基與PEHA中胺基縮合反應(yīng)的溫度，但并未達(dá)到PEHA的碳化溫度，因此反應(yīng)產(chǎn)物中不存在PEHA碳化產(chǎn)生的碳納米材料。第一步反應(yīng)完成后，檸檬酸被轉(zhuǎn)化為石墨烯片，PEHA被共價(jià)連接到石墨烯片邊緣。因此，在第二步反應(yīng)中，只有石墨烯片邊緣上的羧基能與DA分子中的胺基反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)對PEHA-GQD的功能化。

為考察PEHA用量的影響，通過改變PEHA和檸檬酸的比例（PEHA/CA）制備了系列PEHA-GQD。圖2A是PEHA-GQD的熒光光譜。當(dāng)PEHA/CA<0.4時(shí)，隨PEHA的比例增大，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)。這種熒光增強(qiáng)效應(yīng)主要?dú)w因于PEHA的供電子效應(yīng)。一方面，PEHA含有氨基和亞氨基兩種強(qiáng)供電子基團(tuán)，增加了石墨烯片電子云密度，從而導(dǎo)致熒光發(fā)射強(qiáng)度增加。采用更高比例的PEHA將引入更多的供電子基團(tuán)，因此導(dǎo)致更強(qiáng)的熒光發(fā)射。另一方面，PEHA和檸檬酸可通過酸堿反應(yīng)形成鹽。PEHA的供電子效應(yīng)將提高檸檬酸的化學(xué)活性，檸檬酸分子更容易脫水縮合形成更多的石墨烯片，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加。圖2B是不同PEHA-GQD的紫外-可見吸收光譜， 在350 nm處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，它的最大吸收波長明顯大于小分子化合物的紫外吸收，證明形成了具有較大電子共軛體系的石墨烯片。隨著PEHA比例的增加， 350 nm處的吸光度迅速增加，說明形成了更多的石墨烯片。當(dāng)PEHA的比例>0.4時(shí)，熒光發(fā)射強(qiáng)度和吸光度都明顯下降。這可能是因?yàn)闄幟仕崤cPEHA之間的化學(xué)反應(yīng)消耗了檸檬酸分子中的羧基，使檸檬酸熱解形成石墨烯片的能力下降，甚至不能形成石墨烯，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。為了得到高的熒光發(fā)射，選用PEHA/CA=0.4的條件制備PEHA-GQD。

通過改變DA的加入體積，考察了DA用量對PEHA-GQD-DA光學(xué)性質(zhì)的影響。從圖3A可見，PEHA-GQD-DA的熒光發(fā)射強(qiáng)于PEHA-GQD，說明DA的引入進(jìn)一步提高了熒光強(qiáng)度。這是因?yàn)镈A分子中存在強(qiáng)供電子氨基，進(jìn)一步改善了量子點(diǎn)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。然而，當(dāng)DA加入量>15 μL時(shí)，體系中將析出沉淀，降低了水溶液中PEHA-GQD-DA的濃度， 從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。這可能是因?yàn)槭┢吘壣弦胼^多的烷基鏈，導(dǎo)致水溶性明顯降低。因此，本研究選用15 μL DA制備PEHA-GQD-DA。

3.2 結(jié)構(gòu)表征

采用透射電鏡、原子力顯微鏡和紅外光譜對PEHA-GQD-DA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果見圖4。PEHA-CD-DA由準(zhǔn)零維的石墨烯片組成，石墨烯片形貌單一，未發(fā)生明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，尺寸在1～3 nm之間，平均片徑為2.2 nm，小于單獨(dú)檸檬酸制備的石墨烯量子點(diǎn)的平均片徑（5.6 nm）。這是因?yàn)镻EHA可與檸檬酸能迅速反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，消耗了檸檬酸分子中的部分羧基，使石墨烯片的生長受到限制，導(dǎo)致形成較小的石墨烯片。通常，尺寸越小，量子限制效應(yīng)更明顯，可能產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光發(fā)射。3500～3300 cm1之間的吸收帶是NH鍵的對稱伸縮振動(dòng)峰，3500 cm1處的吸收峰為OH鍵的對稱振動(dòng)峰，3000～2800 cm1之間的吸收帶是CH鍵的伸縮振動(dòng)峰，1741、1218、1066和1723 cm1處的吸收峰是COOH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)，3162、1643和1535 cm1處的吸收峰是CONH基團(tuán)的紅外吸收。以上紅外光譜的分析結(jié)果證明，PEHA-GQD-DA中含有OH、 NH2和COOH等功能基團(tuán)。

3.3 光學(xué)性質(zhì)

圖5是PEHA-GQD-DPA的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜。PEHA-GQD-DPA的激發(fā)光譜在356 nm處有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰，最大吸收波長明顯大于小分子化合物，說明形成了具有更大電子共軛體系的石墨烯片[28]。

PEHA-GQD-DPA的熒光發(fā)射峰位于375～600 nm之間，最大發(fā)射波長為450 nm。PEHA-GQD-DPA的熒光量子產(chǎn)率達(dá)到72.7%（以羅丹明B為標(biāo)準(zhǔn)物采用參比法測定），明顯高于以單一檸檬酸為碳源制備的石墨烯量子點(diǎn)（17.2%）[29]，說明PEHA和DA的引入顯著提高了石墨烯量子點(diǎn)的熒光發(fā)射。用氙燈（300 W）對裝有PEHA-GQD-DA溶液的石英比色皿持續(xù)照射，每隔10 min測量溶液在450 nm處的熒光強(qiáng)度。PEHA-GQD-DA溶液的熒光強(qiáng)度在70 min照射時(shí)間內(nèi)基本不變，光穩(wěn)定性良好。

3.4 對pH值的熒光響應(yīng)

圖6是不同pH值下PEHA-GQD-DA的熒光發(fā)射光譜。當(dāng)介質(zhì)pH值<6.5時(shí)，石墨烯量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度（Fp）隨pH值增加而增大，其線性方程為Fp=152.72pH-15.85，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。同時(shí)，不同pH值下熒光光譜也存在明顯差異。最大發(fā)射波長（W）與pH值之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程為W（nm）=6.2539pH + 478.15，R2=0.996。因此，熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射波長均可用于酸性范圍內(nèi)pH值的定量測定。然而，堿性范圍內(nèi)pH值變化不會(huì)引起石墨烯量子點(diǎn)的發(fā)射光譜變化。隨著pH值增加，熒光強(qiáng)度迅速下降，F(xiàn)p與pH值保持良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Fp=113.83pH+1536.6，R2=0.995。因此，熒光強(qiáng)度的變化可用于堿性范圍內(nèi)pH值的定量測定。PEHA-GQD-DA含有豐富的含氧基團(tuán)，因此熒光信號的變化應(yīng)主要?dú)w因于含氧基團(tuán)的質(zhì)子化和離解。

PEHA-GQD-DA的主要功能基團(tuán)是氨基、亞氨基、羥基和羧基，它們可能與過渡金屬離子配合，干擾pH值的光學(xué)響應(yīng)。為評估pH值測定的選擇性，分別測定了加入不同干擾組分后石墨烯量子點(diǎn)體系的熒光光譜變化。結(jié)果表明，1.0 mg/mL的Li+、Ag+、Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Al3+、Cl、SO24或CO23的引入，僅引起峰熒光強(qiáng)度的微小變化（圖7），熒光強(qiáng)度仍保持在最初強(qiáng)度的95%以上。除無機(jī)離子外，環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)還可能存在一些有機(jī)小分子化合物，它們可能與石墨烯量子點(diǎn)之間相互作用，導(dǎo)致體系熒光發(fā)射的改變。研究表明，1.0 mmol/L的葡萄糖、多巴胺、草酸、尿素、谷胱甘肽、賴氨酸的存在并不影響量子點(diǎn)對介質(zhì)pH值的熒光響應(yīng)。因此，本方法具有較好的選擇性。

3.5 實(shí)際水樣pH值的測定

為檢驗(yàn)PEHA-GQD-DA用于水樣pH值測定的實(shí)用性，收集了3個(gè)環(huán)境水樣品（自來水、雨水和湖水）和2個(gè)電鍍廢水樣品，按2.3節(jié)所述方法進(jìn)行熒光測定，結(jié)果列于表1。本法測定結(jié)果與酸度計(jì)的測定結(jié)果具有較好的一致性，表明本方法具有較高的實(shí)用性。

3.6 腫瘤細(xì)胞成像

采用CCK-8方法對PEHA-GQD-DA的細(xì)胞毒性進(jìn)行測試。結(jié)果表明，PEHA-CD-DPA濃度在0～1000 μg/mL之間，細(xì)胞活力保持基本不變，說明PEHA-GQD-DA具有非常低的細(xì)胞毒性。將Hela細(xì)胞與PEHA-GQD-DA孵育不同時(shí)間，然后在共聚焦顯微鏡上進(jìn)行熒光成像。從圖8可見，PEHA-GQD-DA處理2 h后，細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)綠色熒光，且熒光強(qiáng)度不再隨孵育時(shí)間的延長而增強(qiáng)，說明大部分PEHA-GQD-DA已進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。然而，同樣條件下用GQD處理的細(xì)胞的熒光卻很弱。當(dāng)延長孵育時(shí)間到8 h，GQD處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度才達(dá)到最大，但仍十分微弱。PEHA-GQD-DA細(xì)胞成像能力較好，主要?dú)w因于它的特殊結(jié)構(gòu)：一方面，PEHA的引入提高了熒光強(qiáng)度，使成像更為清晰； 另一方面，DA的功能化提供了特殊的雙親結(jié)構(gòu)，使量子點(diǎn)更易通過細(xì)胞膜磷脂雙分子層而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，避免了水溶性量子點(diǎn)滯留在細(xì)胞外的問題。

4 結(jié) 論

通過引入供電子基團(tuán)和烷基鏈， 成功合成了一種雙功能石墨烯量子點(diǎn)，可作為各種光學(xué)檢測和生物成像的熒光探針。通過構(gòu)建具有不同離解和質(zhì)子化的功能基團(tuán)體系，可實(shí)現(xiàn)對介質(zhì)pH值靈敏光學(xué)響應(yīng)，可用于不同需求下pH值的精準(zhǔn)測定及實(shí)時(shí)監(jiān)測。研究結(jié)果表明，功能基團(tuán)的引入可改變石墨烯量子點(diǎn)的性能，明顯改善其光學(xué)性能，為設(shè)計(jì)基于石墨烯量子點(diǎn)的新型熒光材料提供了參考。

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