任文芳,楊潤強(qiáng),顧振新,王 沛
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)
葉酸是指四氫葉酸(THF)及其衍生物,為一種水溶性B族維生素,是生物體的必需成分[1]。葉酸作為一碳代謝中一碳(C1)轉(zhuǎn)移反應(yīng)的輔因子,參與核苷酸生物合成,氨基酸代謝(如,絲氨酸轉(zhuǎn)換為甘氨酸、組氨酸的分解)和甲基化循環(huán)(如,同型半胱氨酸通過再甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?,其中在甲基化循環(huán)時(shí)提供了許多甲基及甲基化反應(yīng)。因此,葉酸及其合成通路對細(xì)胞代謝至關(guān)重要。人體自身無合成葉酸的能力,只能通過飲食攝取。為滿足正常生命活動(dòng)的需要,成年人每天應(yīng)補(bǔ)充400 μg的葉酸,而孕婦每天應(yīng)補(bǔ)充600 μg[2]。業(yè)已證實(shí)葉酸攝入不足則引發(fā)巨幼紅細(xì)胞貧血和胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷(NTD)[3],且低水平的葉酸攝入與老年癡呆癥、心血管疾病和多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[4]。因此,葉酸對人體正常生命活動(dòng)十分重要。
為緩解世界范圍內(nèi)普遍存在著的人體葉酸缺乏狀況,提高植物性食品原料中葉酸的含量具有現(xiàn)實(shí)意義。近年來,植物中葉酸生物合成途徑研究,以及通過基因工程和發(fā)芽調(diào)控手段提高葉酸含量已成為研究熱點(diǎn),隨之,植物源食品中葉酸的提取與檢測也要求更高的準(zhǔn)確度及精確度。本文綜述了植物源食品中葉酸的類型與結(jié)構(gòu)、葉酸合成途徑及相關(guān)酶、葉酸代謝調(diào)控、發(fā)芽富集技術(shù)、葉酸提取與檢測技術(shù),以期為開發(fā)富含葉酸的健康食品提供理論依據(jù)。
葉酸分子由2-氨基-4-羥基蝶啶(蝶呤)、對氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸[5]三部分組成(圖1)[10]。葉酸分子存在多種形式,
圖1 葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of folate
理論上達(dá)150種之多[6],在植物和動(dòng)物組織中僅發(fā)現(xiàn)不到50種。蝶呤環(huán)有完全氧化及部分還原、完全還原形式[1],各種氧化水平的C1基團(tuán)(甲?;喖谆?、甲基等)可以連接于蝶呤的N-5位置或pABA的N-10位置,或是連接在二者之間(表1)[7],產(chǎn)生的C1取代的葉酸經(jīng)酶促反應(yīng)可以相互轉(zhuǎn)化,并且可用作各種反應(yīng)的C1基團(tuán)供體。
表1 葉酸常見種類Table 1 The common species of folate
植物體內(nèi)谷氨酸尾數(shù)從1~8個(gè)不等[2],谷氨酸殘基通過γ位通常連接到第一個(gè)谷氨酸上。其中,單谷氨酸尾形式的葉酸是葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)體所偏好的形式,多谷氨酸尾形式的葉酸則是葉酸依賴型酶所偏好的形式[8]。此外,由于尾部促進(jìn)葉酸與酶的結(jié)合,而葉酸對于氧化裂解在結(jié)合時(shí)比在游離時(shí)更穩(wěn)定,所以多聚谷氨酰化可以直接增強(qiáng)葉酸穩(wěn)定性[9]。
葉酸存在于植物細(xì)胞的液泡、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和質(zhì)體中[11],但葉酸僅在線粒體中合成,蝶呤和pABA前體則分別在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中形成(圖2)[12]。
圖2 植物中葉酸的合成Fig.2 The biosynthesis of folate in plant
尿苷三磷酸(GTP)在GTP環(huán)化水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCHI)作用下轉(zhuǎn)化為二氫新蝶呤三磷酸,該反應(yīng)是喋呤合成的第一步,也是其合成的限速反應(yīng)。在植物體中,GCHI是具有兩個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的同二聚體,其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域類似于典型的GCHI單體[13-14],然后GCHI催化產(chǎn)生的二氫新蝶呤三磷酸產(chǎn)物在兩個(gè)步驟中被去磷酸化形成二氫蝶呤,后又被二氫蝶呤醛縮酶水解成6-羥甲基二氫蝶呤(HMDHP)和乙醇醛[15]。
pABA在葉綠體中合成,并在線粒體中作為前體合成葉酸。pABA合成的前體物質(zhì)是分支酸,該物質(zhì)只能在質(zhì)體中合成,是莽草酸途徑的重要中間代謝產(chǎn)物。在氨基脫氧分支酸合成酶(aminodeoxychorismate synthase,ADCS)和氨基脫氧分支酸裂解酶(aminodeoxychorismate lyase,ADCL)催化下,分支酸生成pABA。pABA可在胞質(zhì)中葡萄糖醛轉(zhuǎn)移酶的催化下可逆地轉(zhuǎn)化成其葡萄糖脂,且植物中全部或大多數(shù)pABA發(fā)生了酯化反應(yīng),以致酯化形式的pABA通常比游離的pABA多,通過合成反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)或酯酶作用,酯可以再轉(zhuǎn)化為pABA[16]。盡管這一酯化反應(yīng)的生理作用尚不清楚,但是植物特有,可能為pABA提供了一種貯存形式,也可能是pABA在植物細(xì)胞中的特殊運(yùn)輸形式[12]。
合成的喋呤復(fù)合物HMDHP和pABA前體被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中,其中HMDHP首先在羥甲基二氫喋呤焦磷酸化酶的作用下通過焦磷酸化活化,然后經(jīng)二氫蝶酸合成酶催化偶聯(lián)到pABA以產(chǎn)生二氫蝶酸。二氫蝶酸進(jìn)一步在二氫葉酸合成酶(dihydrofolate synthase,DHFS)催化下形成單谷氨酸二氫葉酸。二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)協(xié)助下將二氫葉酸還原為單谷氨酸四氫葉酸,最后通過葉酰多谷氨酸合成酶(folypolyglutamate synthase,FPGS)的作用與谷氨酸結(jié)合,合成多谷氨酰四氫葉酸。其中,羥甲基二氫喋呤焦磷酸化酶和二氫蝶酸合成酶是植物中單個(gè)雙功能蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域[17]。DHFS是特殊的植物葉酸合成酶,其功能已經(jīng)由突變體研究確定,編碼DHFS的擬南芥基因的破壞會(huì)導(dǎo)致葉酸缺乏,并且有胚胎致死效應(yīng)[18]。
植物性食品原料,如大豆、水稻、番茄中含有微量的葉酸,可以通過基因工程、種子萌發(fā)等方法使葉酸得以富集,以此提高植物源食品的營養(yǎng)與保健價(jià)值。
利用基因工程手段可有效地增加植物中的葉酸。目前已在大豆、水稻、番茄等植物中導(dǎo)入外源編碼的GCHI、ADCS等基因,葉酸富集效果顯著[19]。
3.1.1 過表達(dá)GCHI 在番茄[20]和擬南芥[21]]的研究中,使用非植物基因(基于哺乳動(dòng)物或細(xì)菌基因)過表達(dá)葉酸合成途徑中蝶啶分支的第一個(gè)酶,即GCHI,該酶無反饋抑制,轉(zhuǎn)基因番茄和擬南芥中的蝶啶水平分別是野生型對照組的140和1250倍;然而,葉酸含量僅分別是野生型對照組的2和4倍,說明僅過表達(dá)一個(gè)分支的酶只是使該途徑產(chǎn)物大量積累,并不能使葉酸產(chǎn)量大幅增加。當(dāng)增加外源性pABA到過表達(dá)GCHI的轉(zhuǎn)基因番茄和擬南芥中,葉酸含量則在此基礎(chǔ)上增加2.5~10倍。此結(jié)果不僅指出增加葉酸前體物質(zhì)—蝶呤和pABA的必要性,同時(shí)也表明在植物細(xì)胞內(nèi)提高葉酸具有較大的生物潛力。
3.1.2 聯(lián)合過表達(dá)GCHI與ADCS 在番茄[22]中過表達(dá)與pABA分支途徑中的第一個(gè)酶-ADCS的相關(guān)基因,與野生型相比較,轉(zhuǎn)基因果實(shí)中含有約19倍的pABA,葉酸水平?jīng)]有增加,然而通過雜交將pABA過量產(chǎn)生性狀與蝶呤過量產(chǎn)生性狀相結(jié)合,得到的雙轉(zhuǎn)基因果實(shí)中葉酸含量比對照多19倍,達(dá)到840 μg/100 g,完全滿足一個(gè)成人的日常需要量。但是,這也導(dǎo)致了高劑量的蝶呤和pABA,約為野生型的20倍。雖然轉(zhuǎn)基因番茄中高pABA水平對人體健康無害,但蝶呤的作用并不清楚[23]。
在水稻胚乳單個(gè)遺傳基因組上的強(qiáng)特異性啟動(dòng)子控制下,擬南芥中編碼GCHI和ADCS的基因得到過表達(dá),可實(shí)現(xiàn)葉酸的生物強(qiáng)化[24]。選用可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)的植物GCHI,可避免非理想型中間體的高積累。與野生型相比,過表達(dá)擬南芥基因的轉(zhuǎn)基因水稻葉酸含量高達(dá)100倍,且生物合成中間體—蝶呤和pABA的水平顯著低于轉(zhuǎn)基因番茄。在強(qiáng)化葉酸的番茄和水稻中,葉酸:pABA:蝶呤的摩爾比分別為1∶2.5∶0.75和1∶0.5∶0.013[25],說明在強(qiáng)化水稻中沒有像在強(qiáng)化番茄中高劑量的中間產(chǎn)物的積累。因此,植物GCHI的使用可能保留了其固有的負(fù)反饋調(diào)節(jié),而與植物ADCS聯(lián)用,可使酶活趨向于平衡,能獲得蝶呤和pABA的最佳通量。
在雙子葉植物(番茄)和單子葉植物(水稻)進(jìn)行的葉酸生物強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)證明同時(shí)增強(qiáng)蝶呤和pABA分支可能適用于其他植物強(qiáng)化葉酸。
種子萌發(fā)后,生命代謝活動(dòng)開始,植物體內(nèi)大量酶原被激活,其內(nèi)部發(fā)生一系列生理生化變化,如在豆類植物中,脂類物質(zhì)在酶的作用下被分解成甘油和脂肪酸,最后生成能夠被人體吸收的糖類;蛋白質(zhì)水解為多肽和氨基酸[26],這有利于人體吸收;維生素[27]、γ-氨基丁酸[28]、異黃酮[29]等生理活性成分含量相應(yīng)提高。因此,芽類食品的保健功能在食品行業(yè)獨(dú)樹一幟,頗受人們歡迎。
植物種子在發(fā)芽后,葉酸含量明顯增加。據(jù)Koehler等[30]的研究發(fā)現(xiàn),小麥在20 ℃下發(fā)芽102 h后,每100 g干物質(zhì)中增加了200 μg葉酸,比未發(fā)芽者增加了3.6倍;100 g干麥芽含有每日建議攝入葉酸量(400 μg)的50%。Hefni等[31]發(fā)現(xiàn)小麥發(fā)芽4 d后,其葉酸含量是原來的4倍,黑麥?zhǔn)窃瓉淼?倍,說明發(fā)芽對黑麥葉酸含量影響更為顯著。黑麥比小麥、大麥和燕麥等其他谷物含有更多的葉酸[32]。Kariluot[33]研究了發(fā)芽溫度對黑麥中葉酸的影響,發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi),葉酸含量隨發(fā)芽溫度升高而升高,提示合適的發(fā)芽條件有利于植物富集葉酸。Shohag等[34]的研究結(jié)果表明,發(fā)芽對2個(gè)大豆品種及2個(gè)綠豆品種葉酸含量的差異是由遺傳因素決定的;各品種的葉酸含量在發(fā)芽4 d時(shí)達(dá)到最大值,之后下降。由此看來,高葉酸濃度僅出現(xiàn)在發(fā)芽的早期階段。Hefni等[35]研究了蠶豆和鷹嘴豆在發(fā)芽期間的葉酸含量變化,發(fā)現(xiàn)浸泡后葉酸含量下降,而發(fā)芽4 d后葉酸增加2.5倍,且葉酸總量的增加主要來源于還原形式葉酸含量的增加,其余形式的葉酸未見增長。谷物及豆類在發(fā)芽期間對甲基(一碳單位)的需求增加從而使葉酸合成加快[36]。從這些研究結(jié)果中我們不難發(fā)現(xiàn),調(diào)控發(fā)芽條件是植物富集葉酸的有效方式,且發(fā)芽富集葉酸的效果顯著,方法簡便易行,在實(shí)際生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。
除基因工程、發(fā)芽調(diào)控等手段提高植物中葉酸含量外,還可從認(rèn)識葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、增強(qiáng)葉酸穩(wěn)定性、加強(qiáng)葉酸補(bǔ)救途徑等方面入手[10]。
認(rèn)識和鑒定葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將葉酸合成前體物質(zhì)高效率地轉(zhuǎn)入線粒體中,以及促進(jìn)葉酸在液泡等不含有葉酸合成相關(guān)酶的亞細(xì)胞區(qū)域內(nèi)儲(chǔ)存,從而避免葉酸大量積累造成的反饋抑制,最終增加植物中葉酸含量。由于5-甲酰四氫葉酸較其他葉酸形式具有高穩(wěn)定性,阻斷將其轉(zhuǎn)化為其他形式葉酸的酶相關(guān)基因的表達(dá),可增強(qiáng)5-甲酰四氫葉酸及葉酸的積累。植物果實(shí)成熟后蝶啶大量氧化[37],引入外源蝶啶還原酶可使其再度用于葉酸合成,有助于增強(qiáng)葉酸補(bǔ)救能力。
植物性食品原料中葉酸含量較低,并受植物種類、收獲季節(jié)、氣候及采后處理等因素的影響[38]。同時(shí)由于葉酸性質(zhì)不穩(wěn)定性[39],極易被熱、光和氧氣氧化降解,且葉酸包埋在基質(zhì)中,不利于提取[40],而且許多生物材料含有內(nèi)源性共軛酶和能夠引起各種形式葉酸相互轉(zhuǎn)化及分布變化的酶類,影響葉酸檢測結(jié)果[41],因而分析植物源食品中葉酸具有挑戰(zhàn)性。
抗氧化劑、α-淀粉酶、蛋白酶及結(jié)合酶、料液比、pH等均影響葉酸的提取效果。
4.1.1 抗氧化劑 在提取葉酸時(shí),由于大部分還原型葉酸穩(wěn)定性差,因此萃取過程中一般都要加用抗氧化劑,通常為抗壞血酸和還原型硫醇單獨(dú)使用或聯(lián)用。Jastrebova等[42]研究了抗壞血酸鹽水平對葉酸穩(wěn)定性的影響,在同樣添加0.1% 2-巰基乙醇的基礎(chǔ)上,分別添加0.5%、1%、2%的抗壞血酸鹽,四氫葉酸的損失率分別為42%、18%、8%,說明2%的抗壞血酸鹽能更好地保證四氫葉酸的穩(wěn)定性。同時(shí),De Brouwer V[43]發(fā)現(xiàn)巰基乙醇通過去除熱處理過程中由抗壞血酸釋放的甲醛來穩(wěn)定四氫葉酸??寡趸瘎ΡWC葉酸的穩(wěn)定性很重要,在提取葉酸時(shí)應(yīng)加入適當(dāng)比例的抗壞血酸、巰基乙醇等。
4.1.2 蛋白酶和淀粉酶 對于富含淀粉和蛋白質(zhì)的大豆、小麥、乳制品等須用α-淀粉酶、蛋白酶及結(jié)合酶三酶聯(lián)合處理,將葉酸從富含蛋白質(zhì)和淀粉的樣品中釋放出來,提高可測定的葉酸含量[44]。對于水果和蔬菜而言,添加淀粉酶、蛋白酶則是不必要的,Shohag[45]發(fā)現(xiàn)這兩種酶的添加對葉酸含量測定的結(jié)果無顯著性影響。
4.1.3 料液比 Patring等[46]研究了料液比對提取酵母中葉酸的影響,對5-甲基四氫葉酸而言,不同的料液比下其提取量無顯著差異。對四氫葉酸而言,一定的提取液所包含的樣品越少,檢測到的葉酸含量越高,這表明樣品組織影響檢測結(jié)果,可能是由于四氫葉酸結(jié)合在樣品組織中,較大的料液比限制了它的釋放。Shohag[47]研究了料液比對提取菠菜時(shí)葉酸回收率的影響,5 g菠菜加入5~40 mL提取液,發(fā)現(xiàn)葉酸回收率先隨著提取液的增加而增加,當(dāng)提取液為15 mL時(shí)達(dá)到最大,之后并沒有顯著的增加,表明合適的料液比可獲得最大的葉酸提取量。
4.1.4 pH 不同形式葉酸在不同pH條件下穩(wěn)定性不同,De Brouwer V[43]研究了pH對不同形式葉酸穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明蝶酰谷氨酸和5-甲基四氫葉酸在pH2~10時(shí)無論加熱與否均相對穩(wěn)定;除去在pH2條件下加熱時(shí)降解25%,10-甲酰葉酸在多數(shù)pH下均呈現(xiàn)較強(qiáng)的穩(wěn)定性;四氫葉酸在pH<5時(shí)呈現(xiàn)不穩(wěn)定性。Zhang等[48]研究了提取液pH對菠菜中葉酸的影響,發(fā)現(xiàn)受pH影響最大的是四氫葉酸,在低pH下,其回收率較低,但隨著pH的升高使提取液達(dá)到中性或堿性時(shí)其回收率可增加至原來的2倍;5-甲基四氫葉酸在酸性條件下則更為穩(wěn)定;5-甲酰四氫葉酸的回收率在pH為5處達(dá)到最大值。因此,在測定葉酸時(shí)應(yīng)選擇pH合適的提取液。
4.1.5 去谷氨酸化 無論是用微生物法還是高效色譜法均無法測出多聚谷氨酸葉酸,故必須使用結(jié)合酶將其降解為單谷氨酸葉酸或雙谷氨酸葉酸。Patring[46]發(fā)現(xiàn),酵母的質(zhì)量和大鼠血清的體積比對于是否能實(shí)現(xiàn)葉酸的完全軛合起至關(guān)重要的作用,但在使用前必須先除去內(nèi)源性葉酸。在去谷氨酸化過程中,經(jīng)常使用的軛合酶有大鼠血漿、大鼠血清、豬腎、雞胰、人類血漿等。酶的選擇取決于應(yīng)用何種分析方法,若使用微生物法,由于雞胰較易獲得,且活性高而廣泛使用。若使用高效液相色譜法,由于該方法分離葉酸單谷氨酸形式,所以選擇最終產(chǎn)物為葉酸單谷氨酸的酶,如豬腎和血漿。
綜上所述,在提取葉酸時(shí),應(yīng)注意選擇合適的料液比,使葉酸充分溶解在中性及偏堿性提取液中,同時(shí)添加抗氧化劑維持葉酸的穩(wěn)定性。對于富含淀粉及蛋白質(zhì)的大豆、小麥、乳制品等樣品,應(yīng)添加蛋白酶及淀粉酶,使葉酸釋放出來。對所有樣品而言,最終都應(yīng)添加結(jié)合酶,將多谷氨酸葉酸降解為單谷氨酸葉酸或雙谷氨酸葉酸,以此提高葉酸檢測量的準(zhǔn)確度。
在樣品經(jīng)過高效液相色譜分析葉酸含量前,固相萃取技術(shù)是常用的凈化處理技術(shù),其中強(qiáng)陰離子交換柱(SAX)被廣泛使用[49-50],Nilsson等[51]探討了固相萃取技術(shù)對樣品中雜質(zhì)的去除作用,結(jié)果表明SAX、苯基封端柱(PH EC)結(jié)合使用時(shí)最大程度地降低了干擾組分,而二者單獨(dú)使用時(shí)對清除5-甲酰四氫葉酸附近的雜質(zhì)并沒有效果。固相萃取技術(shù)效果好,但操作繁瑣,Zhang等[48]使用截留分子量為5 kDa的膜進(jìn)行超濾,可去除部分雜質(zhì),純化效果好。
4.3.1 微生物法 測定葉酸的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.211-2014)方法為微生物法,其主要原理是:葉酸是鼠李糖乳桿菌生長所必需的營養(yǎng)素,在一定控制條件下,將鼠李糖乳桿菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)一段時(shí)間后測定透光率或吸光度值,根據(jù)葉酸含量與透光率(或吸光度值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品中葉酸含量。張旭等[52]比較了酪乳酸桿菌和糞鏈球菌測定葉酸含量的效果,發(fā)現(xiàn)兩種微生物檢測結(jié)果均有良好的重復(fù)性。微生物法有應(yīng)用范圍廣、樣品前處理簡單等優(yōu)點(diǎn),但是有一定的局限性[53],如樣品中其他成分以及環(huán)境添加容易干擾結(jié)果、操作過程復(fù)雜、操作周期長、僅能對葉酸總量進(jìn)行測定,而不能測定單一葉酸。
4.3.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法因其對不同形式的葉酸進(jìn)行分離并進(jìn)行定量分析而在葉酸的檢測中得到廣泛應(yīng)用[54]。而且,高效液相色譜法具有適用范圍廣、分離效果好、操作簡便、分析速度快等特點(diǎn)。
高效液相色譜法的常用檢測器包括熒光檢測器、電化學(xué)檢測器及紫外檢測器等,其中熒光檢測器和電化學(xué)檢測器檢測靈敏度高,但由于葉酸結(jié)構(gòu)的多樣性并不適用于所有的葉酸檢測,UV檢測器可以檢測到所有形式的葉酸,但靈敏度低,以致不能檢測到樣品中含量較低的葉酸[48]。Shohag[55]首次使用LC-UV/FLD獲得發(fā)芽大豆和綠豆葉酸含量和組成數(shù)據(jù),所得出的總?cè)~酸含量與穩(wěn)定同位素稀釋測定法一致,表明該方法可靠性較高。
4.3.3 高效液相色譜-質(zhì)譜法 LC-MS及LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物成分的分析研究,不需要對樣品進(jìn)行繁瑣和復(fù)雜的前處理,具有高效快速、靈敏度高等特點(diǎn),尤其適于含量少、不易分離或在分離過程中容易丟失的組分。因此,該方法自誕生以來便得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。迄今,同位素稀釋法結(jié)合LC-MS檢測被認(rèn)為是檢測葉酸最精確的方法,因?yàn)槭褂猛凰貥?biāo)記的類似物作為內(nèi)標(biāo),糾正了樣品在提取與凈化處理過程中葉酸的損失[55]。
使用LC-MS及LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)時(shí),不同的實(shí)驗(yàn)條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大,Zhang等[48]研究了不同緩沖液對實(shí)驗(yàn)靈敏度的影響,結(jié)果表明,在其中添加0.1%的乙酸,獲得了葉酸和甲氨蝶呤最佳的離子化效果。
由于葉酸對人體健康的重要性,且植物源食品是人體獲取葉酸的主要方式,提高植物源食品中葉酸含量一直是研究熱點(diǎn)。目前,對于植物中葉酸的生物合成途徑有了一定的認(rèn)識,同時(shí)通過基因工程、發(fā)芽調(diào)控手段富集葉酸也取得一定進(jìn)展,但擴(kuò)大基因工程在提高植物源食品中葉酸含量的應(yīng)用范圍及開發(fā)更有效的發(fā)芽調(diào)控富集葉酸技術(shù)仍有待進(jìn)一步研究。鑒于葉酸測定方法較為復(fù)雜,且測定結(jié)果準(zhǔn)確性受眾多因素影響。因此,亟待開發(fā)快速而準(zhǔn)確的葉酸測定方法,同位素稀釋法結(jié)合LC-MS檢測葉酸雖已取得良好進(jìn)展,但仍有待繼續(xù)提高,以滿足研究及生產(chǎn)的需要。掌握葉酸的生物合成途徑,進(jìn)一步開展植物性食品中葉酸的富集與提取技術(shù)研究,將有助于改善世界范圍內(nèi)葉酸缺乏狀況,對消除人體因葉酸缺乏引起的巨幼紅細(xì)胞性貧血、胎兒神經(jīng)發(fā)育缺陷等疾病的發(fā)生,降低心血管疾病、癌癥等發(fā)病率具有重大的意義。
[1]S Jabrin,S Ravanel,B Gambonnet,et al. One-carbon metabolism in plants. Regulation of tetrahydrofolate synthesis during germination and seedling development[J]. Plant Physiology,2003,131(3):1431-1439.
[2]D Blancquaert,S Storozhenko,K Loizeau,et al. Folates and folic acid:from fundamental research toward sustainable health[J]. Critical Reviews in Plant Sciences,2010,29(1):14-35.
[3]J I Rader,B O Schneeman. Prevalence of neural tube defects,folate status,and folate fortification of enriched cereal-grain products in the United States[J]. Pediatrics,2006,117(4):1394-1399.
[4]M Caudill. The Role of Folate in Reducing Chronic and Developmental Disease Risk:An Overview[J]. Journal of Food Science,2010,69(1):55-67.
[5]A D Hanson,J F Gregory Iii. Folate Biosynthesis,Turnover,and Transport in Plants[J]. Annual Review of Plant Biology,2011,62(1):105.
[6]C M Baugh,C L Krumdieck. Naturally occurring folates[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,2010,186(1):7-28.
[7]E A Cossins. The fascinating world of folate and one-carbon metabolism[J]. Canadian Journal of Botany,2000,78(6):691-708.
[8]G Orsomando,De La Garza Rd,B J Green,et al. Plant gamma-glutamyl hydrolases and folate polyglutamates:characterization,compartmentation,and co-occurrence in vacuoles[J]. Journal of Biological Chemistry,2005,280(32):28877.
[9]J R Suh,A K Herbig,P J Stover. New perspectives on folate catabolism[J]. Annual Review of Nutrition,2001,21(21):255.
[10]S Bekaert,S Storozhenko,P Mehrshahi,et al. Folate biofortification in food plants[J]. Trends in Plant Science,2008,13(1):28-35.
[11]Yacoubi B El,S Bonnett,J N Anderson,et al. Discovery of a new prokaryotic type I GTP cyclohydrolase family[J]. Journal of Biological Chemistry,2006,281(49):37586.
[12]孫維洋,李劍芳,牟志美. 植物葉酸的合成、代謝及基因工程研究進(jìn)展[C]. 2008:2229-2230.
[13]G Basset,E P Quinlivan,M J Ziemak,et al. Folate synthesis in plants:the first step of the pterin branch is mediated by a unique bimodular GTP cyclohydrolase I[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2002,99(19):12489-12494.
[14]Shane R Mcintosh,D Brushett,R J Henry. GTP cyclohydrolase 1 expression and folate accumulation in the developing wheat seed[J]. Journal of Cereal Science,2008,48(2):503-512.
[15]闞靜,李莉,許激揚(yáng). 葉酸的生物合成及其代謝工程研究進(jìn)展[J]. 中國生化藥物雜志,2009,30(4):284-286.
[16]E P Quinlivan,S Roje,G Basset,et al. The folate precursor p-aminobenzoate is reversibly converted to its glucose ester in the plant cytosol[J]. Journal of Biological Chemistry,2003,278(23):20731.
[17]Mc I Shaner,H Robertj. Genes of folate biosynthesis in wheat[J]. Journal of Cereal Science,2008,48(3):632-638.
[18]T Ishikawa,C Machida,Y Yoshioka,et al. The GLOBULAR ARREST1 gene,which is involved in the biosynthesis of folates,is essential for embryogenesis in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal for Cell and Molecular Biology,2003,33(2):235-244.
[19]姚琳. 大豆GmGCHI和GmADCS基因共表達(dá)對擬南芥葉酸含量的影響[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.
[20]Eoin P Quinlivan Rocío Díaz de la Garza,Sebastian M J Klaus,Gilles J C Basset,et al. Folate biofortification in tomatoes by engineering the pteridine branch of folate synthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2004,101(38):13720.
[21]Nicole Czarina Juba. Metabolic engineering of the pterin branch of folate synthesis by over-expression of a GTP cyclohydrolase I in peanut[J]. 2011,
[22]Díaz De La Garza Ri,A D Hanson. Folate biofortification of tomato fruit[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007,104(10):4218-4222.
[23]Rocío I Díaz De La Garza,Jesse F Gregory,Andrew D. Hanson. Folate Biofortification of Tomato Fruit[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007,104(10):4218.
[24]S Storozhenko,Brouwer V De,M Volckaert,et al. Folate fortification of rice by metabolic engineering[J]. Nature Biotechnology,2007,25(25):1277-1279.
[25]T Hossain,I Rosenberg,J Selhub,et al. Enhancement of Folates in Plants through Metabolic Engineering[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2004,101(14):5158-5163.
[26]李淑艷. 萌發(fā)過程大豆蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化及營養(yǎng)價(jià)值的研究[D]. 北京:北京林業(yè)大學(xué),2009.
[27]郭紅轉(zhuǎn),陸占國,王彩艷. 豆芽生長過程中維生素C的消長規(guī)律研究[J]. 食品研究與開發(fā),2006,27(2):133-135.
[28]顧振新,蔣振暉. 食品原料中γ-氨基丁酸(GABA)形成機(jī)理及富集技術(shù)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(10):65-69.
[29]王慧芳. 發(fā)芽大豆中異黃酮及GABA的變化動(dòng)態(tài)研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2015.
[30]P Koehler,G Hartmann,H Wieser,et al. Changes of folates,dietary fiber,and proteins in wheat as affected by germination[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(12):4678-4683.
[31]Mohammed Hefni,Cornelia M.Witth?ft. Effect of germination and subsequent oven-drying on folate content in different wheat and rye cultivars[J]. Journal of Cereal Science,2012,56(2):374-378.
[32]E Gujska,A Kuncewicz. Determination of folate in some cereals and commercial cereal-grain products consumed in Poland using trienzyme extraction and high-performance liquid chromatography methods[J]. European Food Research and Technology,2005,221(1-2):208-213.
[33]S Kariluoto,K H Liukkonen,O Myllym?ki,et al. Effect of germination and thermal treatments on folates in rye[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(54):9522-9528.
[34]M J Shohag,Y Wei,X Yang. Changes of folate and other potential health-promoting phytochemicals in legume seeds as affected by germination[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(36):9137-9143.
[35]Mohammed Hefni,Cornelia M. Witth?ft. Folate content in processed legume foods commonly consumed in Egypt[J]. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie,2014,57(1):337-343.
[36]S Jabrin,S Ravanel,B Gambonnet,et al. One-carbon metabolism in plants. Regulation of tetrahydrofolate synthesis during germination and seedling development[J]. Plant Physiology,2003,131(3):1431-1439.
[37]de la Garza R Díaz,E P Quinlivan,S M Klaus,et al. Folate biofortification in tomatoes by engineering the pteridine branch of folate synthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2004,101(38):13720.
[38]J Arcot,A Shrestha. Folate:methods of analysis[J]. Trends in Food Science and Technology,2005,16(6):253-266.
[39]Christiane Ringling,Michael Rychlik. Analysis of seven folates in food by LC-MS/MS to improve accuracy of total folate data[J]. European Food Research and Technology,2013,236(1):17-28.
[40]T H Hyun,T Tamura. Trienzyme extraction in combination with microbiologic assay in food folate analysis:an updated review[J]. Experimental Biology and Medicine,2005,230(7):444.
[41]K Tyagi,P Upadhyaya,S Sarma,et al. High performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry for profiling and quantitative analysis of folate monoglutamates in tomato[J]. Food Chemistry,2015,179:76-84.
[42]Jelena Jastrebova. HPLC detemination of folates in raw and processed beetroots[J]. Food Chemistry,2003,80:579-588.
[43]Brouwer V De,G F Zhang,S Storozhenko,et al. pH stability of individual folates during critical sample preparation steps in prevision of the analysis of plant folates[J]. Phytochemical Analysis,2007,18(6):496-508.
[44]Elena Yazynina. Low folate content in gluten-free cereal products and their main ingredients[J]. Food Chemistry,2008:236-242.
[45]M J Shohag,Q Yang,Y Wei,et al. A rapid method for sensitive profiling of folates from plant leaf by ultra-performance liquid chromatography coupled to tandem quadrupole mass spectrometer[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2017,1040:169-179.
[46]J Patring. Development of a simplified method for the determination of folates in baker’s yeast by HPLC with ultraviolet and fluorescence detection[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53:2406-2411.
[47]Jahidul Islam Shohag.蔬菜葉酸:檢測技術(shù),提高途徑和基因型差異[D].杭州:浙江大學(xué),2013.
[48]Guo-Fang Zhang,Sergei Storozhenko,Dominique Van Der Straeten,et al. Investigation of the extraction behavior of the main monoglutamate folates from spinach by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A,2005,1078(1-2):59.
[49]M Edelmann,S Kariluoto,L Nystr?m,et al. Folate in oats and its milling fractions[J]. Food Chem,2012,135(3):1938-1947.
[50]M J Shohag,Y Y Wei,N Yu,et al. Natural variation of folate content and composition in spinach(Spinacia oleracea)germplasm[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(23):12520-12526.
[51]Charlotte Nilsson,Madelene Johansson,Elena Yazynina,et al. Solid-phase extraction for HPLC analysis of dietary folates[J]. European Food Research and Technology,2004,219(2):199-204.
[52]張旭,馬景宏,魏彤竹. 兩種微生物法測定食品中葉酸含量的比較[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志,2012,24(9):848-849.
[53]石丹,賈云虹,包怡紅,等. 葉酸檢測方法的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 中國乳品工業(yè),2009,37(3):42-45.
[54]汪錦邦,顧鵬,章德宏,等.葉酸分析方法的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2000(3):49-54.
[55]M Rychlik,K Englert,S Kapfer,et al. Folate contents of legumes determined by optimized enzyme treatment and stable isotope dilution assays[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2007,20(5):411-419.