雙水相法分離純化靈芝中 三萜的工藝優(yōu)化

肖叢梅,吳學(xué)謙,,*,徐 娟,許海順,楊勝祥,劉 玲,張亞瑤,趙唯實(shí),熊科輝

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310053;2.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江臨安 311300;3.浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司,浙江麗水 323000)

靈芝(Ganodermalucidum)屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌[1],研究證明其中富含三萜、甾醇、多糖等活性成分[2],具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力[3]、抗氧化、保肝護(hù)肝[4]等多種作用。因此靈芝孢子、靈芝提取物等在我國(guó)被廣泛的用于食藥用產(chǎn)品的開發(fā)。三萜類作為靈芝中關(guān)鍵的脂溶性活性成分之一[5],目前主要采用有機(jī)溶劑回流提取、超聲或微波輔助提取[6]、超臨界CO2萃取[7]等方法進(jìn)行提取。但由于靈芝中含有大量甾醇、脂肪等脂溶性化合物,提取過(guò)程中難以與三萜分離。因此傳統(tǒng)方法將靈芝經(jīng)有機(jī)溶劑提取后,再結(jié)合堿提酸化法對(duì)三萜組分進(jìn)一步分離純化[8],以得到高含量的靈芝三萜產(chǎn)品[9]。雖然堿提酸化法能夠得到較純的三萜組分,但存在有機(jī)溶劑使用量大、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、效率低的缺點(diǎn),因此亟待尋找一種簡(jiǎn)單、綠色、高效的替代方法。

雙水相萃取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展快速的綠色提取技術(shù)[10],其中親水性醇和無(wú)機(jī)鹽組成的親水型雙水相體系,采用均相萃取、異相分離技術(shù),具有傳質(zhì)和分相速度快、無(wú)相乳化現(xiàn)象[11],原料成本低,所使用溶劑易回收、操作簡(jiǎn)便、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[12],已經(jīng)被廣泛用于提取和分離天然產(chǎn)物中黃酮[13]、多酚[14]等小分子活性物質(zhì)。并且雙水相體系也可根據(jù)目標(biāo)物的酸堿特性,利用含酸性或堿性無(wú)機(jī)鹽的雙水相體系實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的一步快速分離[15-16]?；谟H水有機(jī)型雙水相體系的優(yōu)點(diǎn)和靈芝三萜類成分與甾醇、脂肪等脂溶性成分酸堿性不同的特性,本研究采用親水性醇和堿性無(wú)機(jī)鹽建立雙水相體系,以期提供一種操作簡(jiǎn)便、提取效率高的分離純化靈芝三萜的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝細(xì)粉(100目) 浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司;乙腈 美國(guó)Fisher公司;甲醇、乙醇、異丙醇、磷酸鉀、碳酸氫鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度91.7%) 中國(guó)食品藥品檢定研究院;靈芝酸A(純度≥95%) 上海優(yōu)純生物技術(shù)有限公司;其它試劑 均為分析純。

e2695 Series型高效液相色譜分析儀 沃特世科技(上海)有限公司;PL403型分析天平 梅特勒-托利多;DS-8510DTH型超聲波清洗器 上海生析超聲儀器有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;EPOCH2型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;HH-8型恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝粗提液的制備 準(zhǔn)確稱取靈芝細(xì)粉60.00 g,加入95%乙醇600 mL,95 ℃回流提取1 h,重復(fù)3次。過(guò)濾減壓濃縮,無(wú)水乙醇定容至250 mL,為靈芝粗提液。

1.2.2 堿提酸化法分離靈芝三萜 參照文獻(xiàn)[8]中的方法,取25 mL靈芝粗提液溶解于200 mL三氯甲烷中,用等體積飽和碳酸氫鈉溶液萃取4次。用鹽酸將飽和碳酸氫鈉溶液pH調(diào)至4.0后,加入等體積乙酸乙酯萃取3次,減壓蒸餾獲得三萜,紫外分光光度法對(duì)總?cè)铺崛×窟M(jìn)行定量分析,提取物加適量甲醇溶解后過(guò)0.22 μm濾膜,采用高效液相色譜法對(duì)三萜成分進(jìn)行定性分析。

1.2.3 雙水相體系的建立 取1.0 mL靈芝粗提液,加無(wú)水乙醇補(bǔ)足至1.5 mL,向其中分別加入等體積的無(wú)機(jī)鹽溶液(K3PO4、K2HPO4、Na3PO4、Na2CO3、NaHCO3)和親水相醇(甲醇、乙醇、異丙醇)共8.5 mL,使體系總體積為10 mL漩渦振蕩器混合1 min,4000 r/min離心5 min使體系分相。移除上相溶液,下相溶液用等體積乙酸乙酯萃取三次,合并濾液,減壓蒸餾獲得靈芝三萜。考察無(wú)機(jī)鹽(K3PO4、K2HPO4、Na3PO4、Na2CO3、NaHCO3)和親水性醇(甲醇、乙醇、異丙醇)對(duì)成相效果以及對(duì)三萜提取量的影響,建立親水性醇-無(wú)機(jī)鹽雙水相體系。

1.2.4 雙水相相圖的繪制 采用濁度滴定法[17]繪制甲醇-磷酸鉀的雙水相相圖。稱取一定質(zhì)量的磷酸鉀和蒸餾水使其溶解,向其中逐滴加入甲醇,直至溶液出現(xiàn)渾濁,記錄加入醇的質(zhì)量,繼續(xù)加水使體系再次澄清,重復(fù)該步驟,直至獲得足夠數(shù)據(jù)計(jì)算并繪制相圖。

1.2.5 雙水相單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 磷酸鉀溶液濃度的確定 取1.0 mL靈芝粗提液,加無(wú)水乙醇補(bǔ)足至1.5 mL,向其中分別加入等體積自然pH的K3PO4溶液和甲醇共8.5 mL,使體系總體積為10 mL漩渦振蕩器混合1 min,4000 r/min離心5 min使體系分相。移除上相溶液,下相溶液用等體積乙酸乙酯萃取三次,合并濾液,減壓蒸餾獲得的靈芝三萜。磷酸鉀溶液濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/mL,考察磷酸鉀溶液濃度對(duì)靈芝三萜提取量的影響。

1.2.5.2 磷酸鉀溶液pH的確定 用磷酸調(diào)節(jié)0.25 g/mL磷酸鉀溶液pH分別為5.0、7.0、9.0、11.0、13.0,考察磷酸鉀溶液pH對(duì)靈芝三萜提取量的影響。取1.0 mL靈芝粗提液,加無(wú)水乙醇補(bǔ)足至1.5 mL,向其中分別加入等體積不同pH的K3PO4溶液和甲醇共8.5 mL,使體系總體積為10 mL漩渦振蕩器混合1 min,4000 r/min離心5 min使體系分相。移除上相溶液,下相溶液用等體積乙酸乙酯萃取三次,合并濾液,減壓蒸餾獲得靈芝三萜。

1.2.5.3 靈芝粗提液加入量的確定 分別取0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mL靈芝粗提液,總體積不足1.5 mL的加無(wú)水乙醇補(bǔ)足,向其中分別加入等體積的0.25 g/mL K3PO4溶液和甲醇,使體系總體積為10 mL漩渦振蕩器混合1 min,4000 r/min離心5 min使體系分相。移除上相溶液,下相溶液用等體積乙酸乙酯萃取三次,合并濾液,減壓蒸餾獲得靈芝三萜,考察樣品加入量對(duì)靈芝三萜提取量的影響。

1.2.5.4 下相溶液pH的確定 雙水相法和傳統(tǒng)方法的原理都是根據(jù)靈芝三萜與甾醇、脂肪等中性脂溶性成分酸堿性的不同而分離。在雙水相體系中,酸性靈芝三萜溶解于堿性K3PO4,成相后富集在下相。成相后同樣需要對(duì)獲得的下相溶液pH進(jìn)行調(diào)節(jié),使三萜酸化從溶液中完全析出。

因此取1.0 mL靈芝粗提液,加無(wú)水乙醇補(bǔ)足至1.5 mL,向其中分別加入等體積0.25 g/mL的K3PO4溶液和甲醇共8.5 mL,使體系總體積為10 mL漩渦振蕩器混合1 min,4000 r/min離心5 min使體系分相。移除上相溶液,下相溶液用磷酸調(diào)節(jié)pH分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0,等體積乙酸乙酯萃取三次,合并濾液,減壓蒸餾獲得靈芝三萜?？疾煜孪嗳芤簆H對(duì)靈芝三萜提取量的影響。

1.2.6 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇K3PO4溶液濃度、靈芝粗提物加入量、分相后下相溶液pH為變量,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)雙水相提取靈芝三萜體系進(jìn)行優(yōu)化。在正交實(shí)驗(yàn)雙水相體系中,K3PO4溶液與甲醇等體積加入共8.5 mL,樣品加入量不足1.5 mL的加入無(wú)水乙醇補(bǔ)足,體系總體積10 mL。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.3 靈芝三萜的測(cè)定方法

1.3.1 靈芝三萜的定性分析 采用高效液相色譜法,對(duì)雙水相體系和酸堿轉(zhuǎn)換體系提取得到的靈芝三萜樣品進(jìn)行定性對(duì)比分析。色譜條件為:色譜柱:YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A:乙腈;流動(dòng)相B:0.2%醋酸水溶液;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):252 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;洗脫梯度為:0 min(30% A)→ 40 min(32% A)→ 60 min(40% A)→ 65 min(40% A)→ 67 min(30% A)→ 70 min(30% A)[8]。

1.3.2 靈芝總?cè)坪康臏y(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]以香草醛-高氯酸為顯色系統(tǒng),采用紫外分光光度法測(cè)定不同分離方法及不同雙水相分離條件下得到的靈芝三萜樣品中的總?cè)坪?。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為:Y=1.6814x-0.1445,R2=0.9990,線性范圍39.4～197.0 μg/mL。靈芝三萜提取量計(jì)算公式為:

其中:X為經(jīng)標(biāo)曲計(jì)算得到的三萜濃度(μg/mL);V為萃取液體積(mL);M為樣品質(zhì)量(g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS 16.0和Excel 2016數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;Origin 9.1進(jìn)行圖形處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝三萜HPLC液相色譜圖的比較

在HPLC分析中,分別對(duì)傳統(tǒng)方法和雙水相法得到的靈芝三萜樣品進(jìn)行分析。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。由圖可知,兩種方法分離的靈芝三萜樣品的液相圖譜出峰數(shù)量、峰形及色譜峰保留時(shí)間基本一致,且二者中都含有三萜主要標(biāo)志性成分靈芝酸A,因此雙水相系統(tǒng)得到的三萜樣品與傳統(tǒng)堿提酸化法的目標(biāo)產(chǎn)物基本一致。

圖1 不同分離方法分離純化的靈芝三萜HPLC色譜圖Fig.1 HPLC analysis of Ganoderma triterpenoids prepared by different methods

2.2 雙水相體系的確定

親水性醇種類對(duì)三萜得率的影響,結(jié)果見圖2。甲醇、乙醇、異丙醇三種親水性醇,都可以與磷酸鉀快速成相。但由測(cè)定結(jié)果可以看出,甲醇/K3PO4雙水相體系下三萜提取量顯著高于乙醇/K3PO4和異丙醇/K3PO4體系?？赡艿脑蚴羌状紭O性更大,更容易與K3PO4競(jìng)爭(zhēng)水分使下相極性降低,從而有利于弱極性三萜的溶解。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選擇甲醇作為成相的有機(jī)溶劑。

圖2 不同親水性醇的影響Fig.2 Effect of different water-miscible alcohol

在無(wú)機(jī)鹽篩選中,考察了K3PO4、K2HPO4、Na3PO4、Na2CO3、NaHCO3五種堿性無(wú)機(jī)鹽的成相情況,結(jié)果表明Na3PO4、Na2CO3、NaHCO3無(wú)法與甲醇成相,K3PO4和K2HPO4能與甲醇形成穩(wěn)定的雙水相體系,且分相速度快、成相穩(wěn)定。考慮到靈芝中的三萜為酸性成分,因此選擇堿性較強(qiáng)的K3PO4作為構(gòu)建雙水相體系的無(wú)機(jī)鹽。

2.3 甲醇-磷酸鉀雙水相相圖

甲醇-磷酸鉀雙水相相圖如圖3所示,根據(jù)濁點(diǎn)滴定法獲得的數(shù)據(jù),計(jì)算得到磷酸鉀與甲醇成相的臨界值,以磷酸鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制出雙水相相圖。在臨界點(diǎn)上方由于甲醇和鹽的相互排斥作用體系能夠形成互不相容的兩相,甲醇富集于上相,磷酸鉀富集于下相。而在臨界點(diǎn)下方排斥力不足則不能分層成相,呈現(xiàn)為澄清溶液,將臨界點(diǎn)連接后構(gòu)成雙水相相圖。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),甲醇與磷酸鉀形成的體系有很好的分相能力,且成相迅速、成相范圍廣,適合構(gòu)建雙水相體系。

圖3 甲醇-磷酸鉀雙水相相圖Fig.3 Phase diagram of methyl alcohol-K3PO4

2.4 甲醇-磷酸鉀雙水相體系的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 磷酸鉀溶液濃度的影響 在甲醇-磷酸鉀構(gòu)建的雙水相體系中,對(duì)K3PO4溶液的濃度進(jìn)行單因素考察。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.2 g/mL是K3PO4溶液與甲醇成相的臨界值,K3PO4溶液濃度大于等于0.2 g/mL體系才能成相,且成相后下相體積隨K3PO4濃度的升高而增大。不同濃度K3PO4溶液構(gòu)成的雙水相體系,靈芝三萜提取量如圖4所示,在0.2～0.25 g/mL的濃度范圍內(nèi),三萜提取量隨著K3PO4溶液濃度的升高而逐漸增大,在0.25 g/mL時(shí)達(dá)到最大,之后隨著K3PO4濃度繼續(xù)升高三萜得率逐漸降低。這是因?yàn)樵陔p水相的分相過(guò)程中無(wú)機(jī)鹽與有機(jī)溶劑互相爭(zhēng)奪水分子形成締合水合物[19-20],隨著K3PO4濃度升高下相締合水的能力增強(qiáng),能爭(zhēng)奪到更多的水分,從而使得K3PO4解離度增加,有利于酸性的三萜類物質(zhì)的溶解。但是K3PO4溶液濃度過(guò)高,競(jìng)爭(zhēng)得到水分過(guò)多會(huì)導(dǎo)致下相極性大大增大,反而不利于弱極性的靈芝三萜溶解。

圖4 磷酸鉀溶液濃度的影響Fig.4 Effect of K3PO4 solution concentration

2.4.2 磷酸鉀溶液pH的影響 考察磷酸鉀溶液pH對(duì)靈芝三萜提取量的影響,結(jié)果如圖5。在非堿性條件下,靈芝三萜提取量明顯低于堿性條件,這與堿提酸化法分離靈芝三萜[8]的原理一致,即靈芝中酸性的三萜類物質(zhì)與堿性無(wú)機(jī)鹽結(jié)合,實(shí)現(xiàn)與中性的脂溶性成分的分離。對(duì)pH9.0、11.0、13.0堿性范圍內(nèi)的三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果組間F=0.417(p=0.677),p>0.05(α=0.05)。三萜提取量在pH為9.0、11.0、13.0的堿性范圍內(nèi)無(wú)顯著差異,說(shuō)明堿性條件有利于靈芝中的三萜在下相的富集和分離,故K3PO4溶液pH選擇為自然pH13.0,不再對(duì)其pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖5 磷酸鉀溶液pH的影響Fig.5 Effect of the K3PO4 solution pH

2.4.3 靈芝粗提液加入量的影響 靈芝粗提液加入量的影響,結(jié)果如圖6所示,當(dāng)靈芝粗提物加入量較低時(shí)三萜提取量基本維持不變,當(dāng)加樣量增加到1.0 mL時(shí),靈芝中的三萜在該體系下相中的溶解達(dá)到飽和,繼續(xù)增加靈芝粗提物導(dǎo)致雙水相體系不能完全萃取樣品中的全部三萜,提取效率隨樣品加入量的增加顯著下降。這與傳統(tǒng)浸提過(guò)程的規(guī)律基本一致,即在雙水相體系體積不變的條件下,樣品加入量越高相對(duì)的料液比反而越低,提取效率隨之下降。

圖6 靈芝粗提液加入量的影響Fig.6 Effect of the amount of Ganoderma extractive

2.4.4 分相后下相pH的影響 下相pH的影響,結(jié)果如圖7所示。研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)下相溶液pH小于等于3.0時(shí),三萜從溶液中析出,這與傳統(tǒng)方法[8]分離純化三萜時(shí)的現(xiàn)象基本一致。但與傳統(tǒng)方法的不同之處在于,下相溶液在三萜析出的同時(shí),會(huì)有大量無(wú)機(jī)鹽析出。原因是加入的磷酸與K3PO4結(jié)合形成了溶解度較低的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀。此外,由于下相溶液密度較高,即使離心后析出的三萜仍然懸浮在溶液中難以分離,因此調(diào)節(jié)pH后改用乙酸乙酯萃取替代傳統(tǒng)沉淀法分離純化靈芝三萜。由圖7可知,調(diào)節(jié)下相pH為3.0時(shí),三萜提取量最高。

圖7 下相溶液pH的影響Fig.7 Effect of pH in the lower-phase

2.4.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析結(jié)果見表2。極差分析的結(jié)果RB>RC>RA,表明三個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響大小分別是B>C>A。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,雙水相分離純化靈芝三萜的最佳條件為A2B1C3,即0.25 g/mL K3PO4溶液,0.5 mL靈芝粗提液,萃取前調(diào)節(jié)下相溶液pH至4.0。在該雙水相體系中含有10.6%(w/v)K3PO4、42.5%(v/v)甲醇、5%(v/v)靈芝粗提液。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)分析得到的最佳條件A2B1C3進(jìn)行驗(yàn)證,平行實(shí)驗(yàn)三次。結(jié)果顯示,該條件下雙水相分離純化三萜提取量為10.13±0.19 mg/g,高于表2中實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在該正交實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)A2B1C3是最佳條件。

分別按雙水相最優(yōu)條件和傳統(tǒng)酸堿轉(zhuǎn)化法同時(shí)分離純化三萜,在最后一步均采用等體積乙酸乙酯萃取的方法獲得三萜,采用紫外分光光度法測(cè)定總?cè)坪坎⒂?jì)算提取量,各平行實(shí)驗(yàn)三次。結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出,采用雙水相法分離純化的三萜提取量(10.13±0.19) mg/g顯著高于傳統(tǒng)堿提酸化法(7.42±0.09) mg/g,t檢驗(yàn)結(jié)果顯示在α=0.05的顯著性水平上,兩者之間有顯著差異(p<0.01)。

圖8 兩種提取方法的比較Fig.8 Triterpenoids content extracted by different ways

3 結(jié)論

本研究建立了一種雙水相分離純化靈芝三萜的新方法,構(gòu)建了新的甲醇/磷酸鉀雙水相體系。經(jīng)HPLC分析證實(shí),雙水相法分離純化的靈芝三萜樣品,其成分與傳統(tǒng)方法的靈芝三萜成分基本一致,且含有靈芝三萜主成分之一的靈芝酸A。最佳提取條件參數(shù)為:10.6%(w/v)磷酸鉀、42.5%(v/v)甲醇、5%(v/v)靈芝粗提液,成相后調(diào)節(jié)下相溶液pH至4.0。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,靈芝三萜得率較傳統(tǒng)的堿提酸化法提高了36.5%。

該體系價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)便、分離后續(xù)工作處理簡(jiǎn)單,解決了傳統(tǒng)萃取方法體系易乳化、需長(zhǎng)時(shí)間靜置、多次萃取、操作繁瑣的缺點(diǎn),大大提高了樣品分離純化效率。因此,可以認(rèn)為,甲醇/K3PO4雙水相體系是一種簡(jiǎn)單、高效分離純化靈芝三萜的新方法,值得進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn),并且可為開展其它食品中三萜類物質(zhì)的分離制備研究提供借鑒。

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