響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波-微波 協(xié)同提取龍眼殼總黃酮

曾俊美,鄭啟翔,劉杰鳳,羅劍斌,李 穎,*

(1.廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開發(fā)中心,廣東茂名 525000;2.茂名市水果科學(xué)研究所,廣東茂名 525000)

龍眼(DimocarpuslonganLour.)為無患子科植物,俗稱桂圓,原產(chǎn)于我國南部和越南北部的南亞熱帶地區(qū)[1]。在龍眼加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料龍眼殼,造成巨大浪費(fèi),據(jù)邱松山等[2]報(bào)道龍眼殼中含有豐富的多糖、多酚、黃酮類化合物等生物活性成分。黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物中,具有抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化抗衰老、抑菌抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用,是天然的甜味劑、抗氧化劑和色素[3-4]。

目前,已有少數(shù)研究龍眼殼總黃酮的提取方法,如:宋佳玉等[5]采用85%乙醇回流提取龍眼殼總黃酮,加熱回流提取3次得到龍眼殼總黃酮提取率約為4.17%;黃鎖義等[6]采用超聲波乙醇浸提法從龍眼殼中提取黃酮類物質(zhì),測得樣品中總黃酮的含量1.101 mg/mL;劉煥云等[7]研究了微波輔助龍眼殼總黃酮工藝,在最佳工藝條件下總黃酮得率為3.465%,但這些方法存在提取時(shí)間長,提取效率不高等問題,超聲波-微波協(xié)同技術(shù)[8-10]利用微波場的熱效應(yīng)及生物效應(yīng)來加速物質(zhì)地?cái)U(kuò)散與溶解,同時(shí)當(dāng)一定頻率的超聲波作用于溶液時(shí),將會(huì)產(chǎn)生空化作用,溶液中尺寸適宜的小氣泡會(huì)發(fā)生共振現(xiàn)象,超聲空化對細(xì)胞壁產(chǎn)生機(jī)械的修剪力,使細(xì)胞壁破裂,并且,超聲可促進(jìn)溶劑和活性成分的雙向轉(zhuǎn)移[11],因此具有能耗低,效率高,不破壞有效成分等優(yōu)點(diǎn)。近幾年在黃酮等生物活性物質(zhì)提取方面得到了迅猛發(fā)展。

本研究以龍眼殼為試材,采用超聲波-微波協(xié)同提取龍眼殼總黃酮,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件,為實(shí)際生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮龍眼 產(chǎn)于廣東省茂名市,手工剝殼,60 ℃烘干粉碎過40目篩后備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 純度98%，上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為分析純。

XFB-200高速中藥粉碎機(jī) 吉首市中誠制藥機(jī)械廠;DGG-9146A型鼓風(fēng)干燥箱 廣州市德科生物科技有限公司;UV-5500pc紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BILON-ZCW-1000W紫外超聲波微波協(xié)同萃取儀 上海比朗儀器制造有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龍眼殼總黃酮的提取工藝流程 龍眼殼→粉碎(40目)→超聲波-微波協(xié)同提取→抽濾→真空濃縮→鼓風(fēng)干燥(60 ℃,8 h)→龍眼殼粗黃酮提取物

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取龍眼殼干粉若干份于三口平底燒瓶中,每份2.00 g,以總黃酮提取率為指標(biāo),固定微波功率500 W,依次改變超聲波功率、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和溫度,實(shí)驗(yàn)方法如下:

超聲波功率:按液料比30 mL/g加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液,在50 ℃條件下分別于超聲波功率0、100、200、300、400、500 W提取7 min。

液料比:分別按液料比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液,在50 ℃條件超聲(100 W)提取7 min。

乙醇體積分?jǐn)?shù):按液料比30 mL/g分別加入體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液,在50 ℃條件超聲(100 W)提取7 min。

提取時(shí)間:按液料比30 mL/g分別加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液,在50 ℃條件分別超聲(100 W)提取3、5、7、9、11 min。

提取溫度:按液料比30 mL/g分別加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液,分別在30、40、50、60、70 ℃條件超聲(100 W)提取7 min。

1.2.3 響應(yīng)面分析法對龍眼殼總黃酮提取工藝的優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)果,選取液料比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)三個(gè)影響顯著的因素為響應(yīng)實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素,以總黃酮提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert中的響應(yīng)曲面法建立三因素三水平的Box-Behnken模型對龍眼殼總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的因素及水平Table 1 Level and code of independent variable used for response surface analysis

1.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取經(jīng)105 ℃烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg,用60%乙醇溶解后,定容至100 mL容量瓶內(nèi),搖勻,即得0.10 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分別置于25 mL容量瓶中,各加入0.75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2,混勻,放置6 min后加入0.75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3,搖勻,放置6 min后再加入10.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH,然后用60%乙醇溶液稀釋定容至刻度,搖勻靜置12 min。以不含蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的試劑作空白對照,在波長為508 nm處測定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)而計(jì)算回歸方程。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=13.35X+0.0005,R2=0.9999,由數(shù)據(jù)可以分析得出標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的線性關(guān)系。

1.2.5 龍眼殼總黃酮含量的測定 精確吸取0.50 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中,按1.2.2步驟加入各溶液,搖勻,靜置12 min,以不含樣品溶液的試劑作空白對照,在508 nm波長處測定其吸光度。

1.2.6 總黃酮提取率的計(jì)算 對龍眼殼提取液進(jìn)行吸光度測定,由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算求得總黃酮含量,進(jìn)而根據(jù)溶液體積計(jì)算出提取得到的龍眼殼總黃酮含量,根據(jù)下列公式(1)計(jì)算龍眼殼總黃酮提取率[8]:

總黃酮提取率(%)=(C×25×100)/(0.5×m×1000)×100

式(1)

式中:C-蘆丁濃度,mg/mL;m-龍眼殼質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波功率對龍眼殼總黃酮提收率的影響

超聲波功率對龍眼殼總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知,當(dāng)超聲波功率小于100 W時(shí),總黃酮提取率隨超聲波功率的增加而增大,而當(dāng)超聲波功率大于100 W后,總黃酮提取率呈下降趨勢,這可能是因?yàn)槌暡ㄗ饔眉铀倭她堁蹥ぶ械狞S酮類物質(zhì)進(jìn)入溶劑,從而增加了總黃酮提取率;但超聲波功率過大,黃酮類物質(zhì)可能發(fā)生分解導(dǎo)致提取率下降[6],因此選擇最佳超聲波功率為100 W。

圖1 超聲波功率對總黃酮提取率的影響Fig.1 The influence of ultrasonic wave power on the yield of total flavonoids

2.2 液料比對龍眼殼總黃酮提取率的影響

液料比對龍眼殼總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知,當(dāng)液料比低于30 mL/g 時(shí),隨著液料比的增大,總黃酮的提取率逐漸增加,這是因?yàn)樵龃笠毫媳却龠M(jìn)了龍眼殼粉末顆粒與溶劑之間的接觸面,降低了黃酮類物質(zhì)向溶劑中溶出的阻力,使得總黃酮提取率增加;當(dāng)液料比大于30 mL/g時(shí),隨著液料比的繼續(xù)增加,總黃酮的提取率反而有所下降,這是因?yàn)槿軇┯昧窟^大,過多的溶劑會(huì)對微波、超聲波產(chǎn)生一定的吸收,影響龍眼殼對能量的吸收,也可能是因?yàn)槿軇w積過大時(shí)傳質(zhì)過程受到影響[12-13]。綜上選擇最佳液料比為30 mL/g。

圖2 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.2 The influence of liquor-material ratio on the yield of total flavonoids

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對龍眼殼總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對龍眼殼總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可以看出,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時(shí),總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加,而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%后,提取率呈下降趨勢。其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)太小會(huì)造成提取不完全,而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí),一些脂溶性的物質(zhì)的溶出量增大,使得黃酮類物質(zhì)的溶解度降低[14],從而導(dǎo)致龍眼殼黃酮類化合物提取率降低,因此選擇體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液為最適提取液。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.3 The influence of Volume fraction of ethanol on the yield of total flavonoids

2.4 提取時(shí)間對龍眼殼總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對龍眼殼總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知,龍眼殼中總黃酮提取率隨超聲波微波協(xié)同提取時(shí)間的延長先增大后減少,當(dāng)提取時(shí)間為5 min時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大,但當(dāng)提取時(shí)間大于5 min,隨著時(shí)間的增加總黃酮提取率有所降低,這可能是由于當(dāng)超聲波微波處理時(shí)間大于5 min時(shí),會(huì)使黃酮類物質(zhì)發(fā)生分解,致使總黃酮提取率略有下降[9,15-16],也可能是由于樣品中的蛋白質(zhì)分子吸收了足夠的熱量而發(fā)生變形凝聚,阻礙了提取溶劑與黃酮之間的傳質(zhì)作用[10]。因此選擇最適提取時(shí)間為5 min。

圖4 提取時(shí)間對龍眼殼總黃酮提取率的影響Fig.4 The influence of extraction time on the yield of total flavonoids of longan shell

2.5 提取溫度對龍眼殼總黃酮提取提取率的影響

提取溫度對龍眼殼總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可以看出,隨著溫度不斷升高,龍眼殼總黃酮的提取率不斷增加,當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí),總黃酮提取率隨溫度增加顯著增長,當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí),繼續(xù)升溫,總黃酮提取率呈緩慢下降的趨勢,這可能是因?yàn)楦邷厥谷軇┱扯冉档?分子運(yùn)動(dòng)加快,從而加快生物活性物質(zhì)的溶出,但溫度過高會(huì)使得熱敏性化合物降解為小分子化合物,導(dǎo)致得率降低[17]。因此選擇最佳提取溫度為60 ℃。

圖5 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.5 The influence of microwave heating temperature on the yield of total flavonoids

2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)號13～17為5個(gè)中心實(shí)驗(yàn),用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差,其他為析因?qū)嶒?yàn)。

表2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,建立二次響應(yīng)面回歸模型,方差分析結(jié)果見表3,響應(yīng)面圖見圖6。

表3 擬合回歸方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖6 兩因素交互作用對龍眼殼總黃酮提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 The response surface map and contour map drawn from two-factor interactions on the yield of total flavonoids of longan shell注：固定水平:微波功率500 W;超聲波功率100 W;乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。

各因素經(jīng)回歸擬合后,得到回歸方程如下:

Y=3.07-0.065A-0.20B-0.083C+0.020AB-0.16AC-0.16BC-0.21A2-0.31B2-0.20C2

式(2)

通過對響應(yīng)面回歸方程的分析確定最佳超聲波-微波協(xié)同提取龍眼殼中總黃酮的工藝參數(shù)為液料比為29.19∶1 mL/g、提取溫度為56.82 ℃、提取時(shí)間為4.96 min,考慮到實(shí)際操作中的局限性,對最佳工藝條件進(jìn)行如下修正:液料比為29.2∶1 mL/g、提取溫度57 ℃、提取時(shí)間5 min。此條件下由公式(2)算出的龍眼殼總黃酮提取率的理論值為3.108%。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行三組重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到龍眼殼總黃酮的平均提取率為3.06%,測定結(jié)果穩(wěn)定,與理論預(yù)測值接近,說明該模型有效。

3 結(jié)論

本文考察了龍眼殼總黃酮的超聲波微波協(xié)同提取工藝,通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了超聲波功率、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和溫度五個(gè)因素對總黃酮提取率的影響,應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳的提取工藝條件:超聲波功率為100 W,液料比為29.2∶1 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,提取溫度為57 ℃,提取時(shí)間為5 min,在此條件下測得龍眼殼的總黃酮提取率為3.06%,該工藝條件可對龍眼殼相關(guān)研究提供參考和依據(jù)。

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