肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及其 毒素B1合成的影響

王一非,卞文怡,劉竹臻,何 艷,宋曉秋,黃雨晴

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué),香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418)

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,對(duì)人類和動(dòng)物都有極大危害[1-3]。最常見(jiàn)的真菌毒素是由黃曲霉、寄生曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素,它于1993年被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物[4-6]。在天然污染的食品中,以黃曲霉毒素B1(AFB1)最為多見(jiàn),其毒性和致癌性也最強(qiáng)[7-10]。因此,建立真菌毒素(特別是黃曲霉毒素)高效防控措施,對(duì)保障食品安全和消費(fèi)者健康具有重要意義。研究表明,通過(guò)抑制菌絲生長(zhǎng)可有效控制黃曲霉毒素合成[11-13]?；瘜W(xué)防腐劑常被用來(lái)抑制真菌的生長(zhǎng)和繁殖,但其殘留物的致癌致畸及劇毒性會(huì)引發(fā)很多環(huán)境和健康問(wèn)題[14-16]。因此,學(xué)者們開(kāi)始致力于天然物質(zhì)的抑菌性能研究,以滿足公眾對(duì)不含化學(xué)防腐劑的純天然食品的需求。

植物精油(cinnamon essential oil,CEO)是芳香植物高度濃縮的提取物,具有良好的抑菌性能,并符合美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的安全性(GRAS)認(rèn)證。植物精油對(duì)霉菌的初級(jí)、次級(jí)代謝及形態(tài)均有一定影響,且病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)較低[17-19],但精油在食品中應(yīng)用時(shí),這可能會(huì)改變食物原有的口感和風(fēng)味。以蒸氣接觸代替直接添加的方式,將植物精油作為活性抑菌因子應(yīng)用在食品包裝材料或食品儲(chǔ)存密閉空間中,能夠降低對(duì)食品感官的破壞,提升食品機(jī)器包裝的質(zhì)量和安全,并有效延長(zhǎng)食品的貨架期[20-23]。

肉桂精油是一種常見(jiàn)的植物精油,其液態(tài)形式下對(duì)多種腐敗微生物的作用效果被前人研究證實(shí),如趙丹等[15]發(fā)現(xiàn)肉桂精油對(duì)黑曲霉、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑制效果;Al-Gahtani等[24]研究發(fā)現(xiàn)在百里香,大蒜,肉桂,薄荷和迷迭香等眾多精油中,肉桂精油對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)和黃曲霉毒素生產(chǎn)的抑制作用效果最為顯著。近年來(lái),肉桂精油蒸氣抑菌活性研究也逐漸吸引了研究者的目光。劉曉麗等[10]研究了肉桂精油氣相的體外抑菌活性,發(fā)現(xiàn)其對(duì)霉菌的抑制效果要優(yōu)于酵母菌和細(xì)菌。Goni等[17]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油蒸氣對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑菌效果。多項(xiàng)研究證實(shí),肉桂精油的氣相組成包括肉桂醛、丁香油酚、石竹烯、芳樟醇、黃樟醚等,其中肉桂醛是主要抑菌成分[8,11]。然而,與精油液相抑菌研究相比,涉及蒸氣形式的應(yīng)用探索還比較少,關(guān)于肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉作用效果、作用方式、毒素產(chǎn)生等方面的系統(tǒng)研究相對(duì)缺乏?；诖?本文旨在以熏蒸處理的方式,探究肉桂精油對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及其毒素B1合成的影響,并明確水分活度和熏蒸時(shí)間對(duì)蒸氣抑菌效果的影響,從而為肉桂精油蒸氣作為黃曲霉生長(zhǎng)及毒素合成抑制劑的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)毒黃曲霉(Aspergillusflavus) AS3.4408由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供,4 ℃保藏于查氏(Czapek)培養(yǎng)基斜面;肉桂精油 封裝在棕色玻璃瓶中避光冷藏,上海彩呈實(shí)業(yè)有限公司;黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 上海纖檢儀器有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、酵母提取物 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;Parafilm封口膜 美國(guó)Bemis公司;氯化鈉、氯仿、甲醇、蔗糖、七水硫酸鎂、硝酸鉀等 均為分析純。

SPX-150R-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;LS-B50L立式壓力蒸氣滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠;Aw-1A型智能水分活度儀 無(wú)錫市碧波電子設(shè)備廠;XSP-BM-8CA生物顯微鏡 上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造公司;RE52-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞容生化儀器廠;HYG-A全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉桂精油蒸氣濃度對(duì)黃曲霉菌絲體徑向生長(zhǎng)的影響 參考Phillips等[7]的方法,將黃曲霉接種在PDA平板中央,28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,用無(wú)菌打孔器自平板培養(yǎng)物邊緣切下菌絲塊(直徑10 mm),并接種于新的PDA平板中央,平板倒置,將一無(wú)菌濾紙片(直徑15 mm)貼在平板蓋中央,移取不同體積精油于濾紙片上,使平板空間精油濃度分別為15.38、46.15、76.92、107.69、138.46、184.61 μL/L,其空間濃度計(jì)算參考Aguilar-González等[25]的方法。對(duì)照組為不添加肉桂精油的濾紙片。然后用Parafilm封口膜密封平板,28 ℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑,確定肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉菌絲體徑向生長(zhǎng)的影響。菌絲體徑向生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。每個(gè)濃度梯度3塊平板,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

菌絲體徑向生長(zhǎng)抑制率(%)=(dc-dt)/dc×100

式(1)

式(1)中,dc為對(duì)照組菌落直徑(cm);dt為精油蒸氣處理組菌落直徑(cm)。

1.2.2 肉桂精油蒸氣濃度對(duì)黃曲霉孢子的影響 參考Phillips等[4]和López等[7]的方法,用10 mL無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)7 d的黃曲霉斜面得到孢子,將孢子懸浮液濃度調(diào)整至5×105個(gè)/mL,取0.2 mL涂布于PDA平板。取不同體積肉桂精油滴加于直徑為15 mm的濾紙片上,使平板空間精油終濃度分別為1.54、3.08、4.62、6.15、7.69 μL/L,對(duì)照組為不添加肉桂精油的濾紙片。倒置平板,把濾紙片貼在皿蓋中央,然后用Parafilm封口膜密封平板,28 ℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量抑菌圈直徑(cm)。每個(gè)濃度梯度3塊平板,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 肉桂精油蒸氣作用時(shí)間對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的影響 參考López等[4]的方法,用無(wú)菌打孔器在培養(yǎng)7 d的黃曲霉平板上打取直徑10 mm的菌塊,置于新的PDA平板中央。將一定體積的精油添加于直徑15 mm的無(wú)菌濾紙片上,貼于皿蓋中央,使平板空間精油濃度為76.92 μL/L,精油分別對(duì)黃曲霉熏蒸0、1、3、6 d后,用另一無(wú)菌平板蓋代替含濾紙片的平板蓋,繼續(xù)于28 ℃培養(yǎng)7 d,用Parafilm封口膜密封平板,每天觀察抑菌效果,并測(cè)量菌落直徑(cm)。每個(gè)處理3塊平板,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 培養(yǎng)基水分活度對(duì)肉桂精油蒸氣抑制黃曲霉的影響 參考Gardini等[8]的方法,向50 mL PDA培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的NaCl作為保濕劑,充分溶解,使水分活度分別達(dá)到0.99、0.98、0.96、0.94、0.92,趁熱倒入平板中。濾紙片上添加肉桂精油,使平板空間精油濃度為76.92 μL/L,檢測(cè)水分活度對(duì)肉桂精油蒸氣抑制黃曲霉菌絲體和孢子的影響,接種、培養(yǎng)及測(cè)量計(jì)算方法同1.2.1、1.2.2。每個(gè)處理3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉毒素B1(AFB1)合成的影響 肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉的抑毒性實(shí)驗(yàn)在蔗糖酵母(SMKY)液體培養(yǎng)基[1,9](蔗糖200 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KNO30.3 g,酵母提取物 7.0 g,水1L,pH5.6±0.2)中進(jìn)行。直徑20 mm無(wú)菌濾紙片上滴加不同體積肉桂精油并懸掛于錐形瓶?jī)?nèi),使瓶?jī)?nèi)頂端空間精油濃度分別為32.93、65.87、98.80、131.74、164.67 μL/L,培養(yǎng)過(guò)程中濾紙片不與培養(yǎng)基接觸,對(duì)照組為不添加肉桂精油的濾紙片。將1 mL黃曲霉孢子懸浮液(約106個(gè)孢子/mL)接種于含50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,置于28 ℃培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)結(jié)束后,液體培養(yǎng)基中的菌絲用預(yù)干燥的濾紙過(guò)濾、100 ℃干燥至恒重后,測(cè)定菌絲干重。濾液在分液漏斗(250 mL)中用25 mL氯仿抽提兩次,提取物合并蒸發(fā)至干燥,殘留物重懸于1 mL甲醇∶水(體積比1∶1)溶液,用于AFB1產(chǎn)量的測(cè)定[1,3]。AFB1的檢測(cè)根據(jù)黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。AFB1抑制率通過(guò)式(2)計(jì)算:

AFB1抑制率(%)=(Cc-Ct)/Cc×100

式(2)

式(2)中,Ct是添加精油的處理組的AFB1的濃度(μg/L);Cc是不添加精油的對(duì)照組的AFB1的濃度(μg/L)。

1.2.6 肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉表面細(xì)胞形態(tài)的影響 用無(wú)菌水沖洗黃曲霉斜面,振蕩均勻,將孢子懸浮液濃度調(diào)整至5×105個(gè)/mL,取0.2 mL涂布于PDA平板。將直徑為15 mm的無(wú)菌濾紙片貼在皿蓋中央,取純精油于濾紙片上使平板空間精油濃度為76.92 μL/L,對(duì)照組為不添加肉桂精油的濾紙片,然后用Parafilm封口膜密封平板。將平板置倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)7 d。用接種環(huán)從培養(yǎng)基表面取出黃曲霉,放在乳酸苯酚棉藍(lán)液滴中分散固定,于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SAS(V 8.02)軟件中的ANOVA進(jìn)行鄧肯多重差異分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油蒸氣濃度對(duì)黃曲霉菌絲體徑向生長(zhǎng)的影響

不同濃度肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉菌絲體徑向生長(zhǎng)的抑制效果見(jiàn)圖1。由圖1可知,實(shí)驗(yàn)中不同濃度肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉菌絲體均有顯著抑制作用(p<0.05),且菌絲生長(zhǎng)抑制率和精油蒸氣濃度成正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.93),即抑制率隨著濃度增大而加強(qiáng)。當(dāng)肉桂精油蒸氣濃度為76.92 μL/L時(shí),抑制率為62.65%;濃度為138.46 μL/L和184.61 μL/L時(shí),抑制率均超過(guò)75.00%。

不同濃度肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉孢子的抑制效果見(jiàn)圖2。所有濃度的肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉孢子均有抑制效果,并且抑菌圈直徑同精油蒸氣濃度成正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.96)。對(duì)照組孢子長(zhǎng)滿平板,無(wú)可測(cè)抑菌圈。當(dāng)肉桂精油蒸氣濃度為1.54 μL/L時(shí),抑菌圈直徑為1.53 cm;濃度為7.69 μL/L時(shí),抑菌圈直徑已達(dá)到5.63 cm,具有較好的抑制效果。

圖2 肉桂精油蒸氣濃度對(duì)黃曲霉孢子的影響Fig.2 Effect of concentrations cinnamon essential oil vapor on the spores of A. flavus

2.2 肉桂精油蒸氣作用時(shí)間對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的影響

將直徑為10 mm的黃曲霉菌塊經(jīng)過(guò)76.92 μL/L肉桂精油蒸氣處理1、3、6 d后轉(zhuǎn)移到無(wú)精油蒸氣的環(huán)境中,繼續(xù)培養(yǎng)7 d觀察黃曲霉菌落的直徑結(jié)果(圖3)。熏蒸不同時(shí)間的菌絲均能夠繼續(xù)生長(zhǎng),但與未經(jīng)精油蒸氣處理的對(duì)照(8.30 cm)相比,精油蒸氣處理時(shí)間長(zhǎng),黃曲霉菌落生長(zhǎng)的越慢。熏蒸6 d的菌塊在繼續(xù)培養(yǎng)7 d后菌落直徑為6.18 cm,且在培養(yǎng)的第4 d后生長(zhǎng)處于停滯狀態(tài)。結(jié)果表明肉桂精油蒸氣可以有效抑制黃曲霉菌絲以及孢子的生長(zhǎng),這與López[4]、劉曉麗等[10]的發(fā)現(xiàn)類似。

圖3 肉桂精油蒸氣作用時(shí)間對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of time on the inhibition of cinnamon essential oil vapor on A.flavus

2.3 水分活度對(duì)肉桂精油蒸氣抑制黃曲霉的影響

培養(yǎng)基水分活度的變化對(duì)肉桂精油蒸氣抑制黃曲霉生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。水分活度對(duì)肉桂精油蒸氣抑制黃曲霉菌絲體的徑向生長(zhǎng)和孢子均具有顯著影響(p<0.05)。當(dāng)水分活度≤0.98時(shí),76.92 μL/L肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉的抑制率比對(duì)照組高35.09%,達(dá)到100%。抑菌圈直徑與水分活度呈負(fù)相關(guān),水分活度越小,肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉孢子的抑制效果越好,當(dāng)水分活度不超過(guò)0.98時(shí),76.92 μL/L肉桂精油蒸氣可完全抑制黃曲霉孢子的生長(zhǎng),跟Passone等[12]在研究植物精油蒸氣抑菌時(shí)得到的結(jié)果相似。由于揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌能力隨著蒸氣壓的升高而增強(qiáng),水分活度的降低會(huì)導(dǎo)致蒸氣壓的升高[13],因此低水分活度下肉桂精油蒸氣的抑菌能力較強(qiáng)。

表1 水分活度對(duì)肉桂精油蒸氣抑制黃曲霉的影響Table 1 Effect of Aw on the inhibition of cinnamon essential oil vapor against A. flavus

2.4 肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉毒素B1合成的影響

不同濃度的肉桂精油蒸氣對(duì)液體培養(yǎng)基中黃曲霉菌絲干重及AFB1的合成的影響見(jiàn)表2。不同濃度的精油蒸氣均能抑制菌絲生長(zhǎng)和AFB1的合成,且兩者成正相關(guān),即菌絲生長(zhǎng)被抑制時(shí),AFB1的合成量降低。當(dāng)精油蒸氣濃度達(dá)到131.74 μL/L時(shí),AFB1的合成和黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)被完全抑制。結(jié)合黃曲霉菌絲生長(zhǎng)抑制結(jié)果,推測(cè)肉桂精油蒸汽抑制AFB1合成的機(jī)理可能是其揮發(fā)性成分抑制菌絲生長(zhǎng),并通過(guò)作用于一些糖代謝途徑的關(guān)鍵酶而引起合成AFB1能力降低的綜合結(jié)果[23]。

表2 肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉菌絲干重及合成AFB1的影響Table 2 Effects of cinnamon essential oil vapor on dry mycelium weight and aflatoxin B1 synthesis of A. flavus

2.5 肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉表面細(xì)胞形態(tài)的影響

利用光學(xué)顯微鏡觀察肉桂精油蒸氣處理的黃曲霉細(xì)胞形態(tài),結(jié)果見(jiàn)圖4,正常生長(zhǎng)的對(duì)照組黃曲霉較完整,菌絲體形狀規(guī)則,平均直徑約為10.72±2.65 μm,分生孢子數(shù)量多且直徑較一致;處理組的黃曲霉孢子明顯減少且不均一,菌絲體瘦小,平均直徑約為(4.83±1.57) μm,在棉藍(lán)染色過(guò)程中易著色。

圖4 肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉形態(tài)的影響Fig.4 Morphology of A. flavus treated with cinnamon essential oil vapor

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明,肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)以及AFB1的合成均有顯著的抑制效果,且抑菌活性能通過(guò)降低水分活度等手段得以增強(qiáng)。不過(guò),移除精油蒸氣形成的抑菌環(huán)境后,黃曲霉重新開(kāi)始生長(zhǎng),表明肉桂精油蒸氣對(duì)黃曲霉產(chǎn)生的是靜態(tài)效應(yīng)。在后續(xù)研究中,可以將精油熏蒸用于體內(nèi)(invivo)實(shí)驗(yàn),可以同時(shí)探究作用時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)、毒素分泌和食品感官品質(zhì)的影響,從而找出精油蒸氣在食品防腐應(yīng)用中的適宜作用方式。綜上可知,熏蒸可能是植物精油在食品保鮮領(lǐng)域使用的一種重要形式,肉桂精油蒸氣有望用于抑制食品貯藏期間霉菌的生長(zhǎng),減少化學(xué)合成真菌防腐劑的使用,有效提高食品的質(zhì)量和安全。

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