具有α-淀粉酶分泌活性 而低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的酵母菌構(gòu)建

王 佳,胡蘭蘭,陳福生,張秀艷,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)

淀粉是廣泛存在于自然界的一種生物資源,常被用來(lái)生產(chǎn)酒精或其他酒類。釀酒酵母(Saccharmoycescerevisiae)因其高乙醇生產(chǎn)能力而常被用于酒類的生產(chǎn)[1]。然而釀酒酵母不能直接利用淀粉,因此淀粉首先要經(jīng)過(guò)蒸煮糊化、加酸或經(jīng)淀粉酶、糖化酶水解成可發(fā)酵性糖才能被酵母利用,這無(wú)疑增加了酒精發(fā)酵的成本,使生產(chǎn)工藝復(fù)雜化[2]。α-淀粉酶(α-amylase)廣泛存在于生物體內(nèi),在已知酵母中,扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)和桔林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae)具有高的淀粉酶活性[3]。研究者曾將不同來(lái)源的淀粉酶基因在釀酒酵母中表達(dá)[4-9]。

在酒精的發(fā)酵生產(chǎn)中,釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的精氨酸酶使精氨酸轉(zhuǎn)化成尿素和CO2,尿素與乙醇反應(yīng)生成了具有致癌作用的氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC),該EC合成途徑是酒類,尤其是黃酒中EC形成的主要途徑[10-17]。為了減少酒中EC含量,課題組曾通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建了精氨酸酶基因缺失的釀酒酵母菌株SΔcar1[18]。

為了使低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的SΔcar1菌株具有水解淀粉的能力,本文擬從扣囊腹膜酵母中克隆α-淀粉酶基因,并分別與含ADH1和ADH2啟動(dòng)子載體連接以構(gòu)建含α-淀粉酶的表達(dá)載體pADH1/ALP1和pADH2/ALP1,分別將重組載體轉(zhuǎn)入精氨酸酶基因缺失的SΔcar1菌株中以構(gòu)建可利用淀粉而低產(chǎn)氨基甲酸乙脂的酵母菌株。在此基礎(chǔ)上,比較分析其在固體和液體培養(yǎng)基中產(chǎn)淀粉酶以及葡萄糖對(duì)α-淀粉酶表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliDH5α、釀酒酵母SΔcar1、扣囊復(fù)膜酵母、pADH1和pADH2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品生物技術(shù)與安全實(shí)驗(yàn)室保存;分子生物學(xué)試劑 大連寶生物工程(Takara)有限公司;酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖等 國(guó)產(chǎn)分析純。

LB 培養(yǎng)基 5 g/L酵母浸粉,10 g/L 胰蛋白胨,10 g/L 氯化鈉),篩選平板用含100 μg/mL的氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基;YEPD培養(yǎng)基 10 g/L酵母浸粉,20 g/L蛋白胨,20 g/L葡萄糖;YNBS培養(yǎng)基 6.7 g/L YNB,10 g/L 可溶性淀粉;YNBG培養(yǎng)基 6.7 g/L YNB,20 g/L葡萄糖;YPGS培養(yǎng)基 10 g/L淀粉,20 g/L蛋白胨,10 g/L酵母浸膏,20 g/L葡萄糖；所有固體培養(yǎng)基 均含1.5%瓊脂糖。

SW-CJ-IF超凈工作臺(tái) 蘇中凈化設(shè)備有限公司;WD-9413B 凝膠成像分析儀 北京六一生物科技有限公司;T960型PCR儀 杭州博日科技有限公司;DYY-8C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和合成 在構(gòu)建低產(chǎn)EC而可利用淀粉的酵母(命名為SΔcar1-A)中,用Primer 5.0 設(shè)計(jì)的引物如表1所示。

表1 所用引物Table 1 Used primers

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及酵母轉(zhuǎn)化 扣囊復(fù)膜酵母總DNA的提取方法按文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行,以扣囊復(fù)膜酵母總 DNA 為模板,分別以ALP1a-L和ALP1a-R,ALP1-L和ALP1-R為引物擴(kuò)增α-淀粉酶編碼序列。大腸桿菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取,片段和質(zhì)粒的酶切連接、酵母轉(zhuǎn)化參見(jiàn)Sambrook[20]。用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NcoⅠ酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物和pADH1,用限制性內(nèi)切酶SalⅠ、KpnⅠ酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物和pADH2后,用T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行篩選,得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒被命名為pADH1/alp1和pADH2/alp1。在1.5 mL無(wú)菌離心管中加入待轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒0.5 μL(500 ng/μL),然后加入10 μg/mL鮭魚(yú)精DNA(用前沸水浴20 min 后立即置于冰浴中),然后加入50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞和500 μL PEG/LiAc,輕輕混勻后30 ℃保溫30 min,加入20 μL DMSO混勻,42 ℃水浴15 min后6000 r/min離心1 min,棄上清,用1 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸;30 ℃保溫90 min后6000 r/min離心1 min,棄上清,沉淀用1 mL 50 mmol/L NaCl重懸,進(jìn)行稀釋后涂在以淀粉為唯一碳源的YNBS培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d(28 ℃),用碘熏蒸法[21]進(jìn)行陽(yáng)性克隆子的篩選。挑取有透明圈產(chǎn)生的酵母菌落,用淀粉酶基因擴(kuò)增引物進(jìn)行菌落鑒定。將含有pADH1/alp1的酵母命名為SΔcar1/A1,將含有pADH1/alp2的酵母命名為SΔcar1/A2。

1.2.3 葡萄糖對(duì)SΔcar1/A1和 SΔcar1/A2在YNBG平板上α-淀粉酶表達(dá)的影響 分別將SΔcar1、SΔcar1/A1和SΔcar1/A2接種至5 mL YEPD培養(yǎng)基中,28 ℃,180 r/min培養(yǎng)至OD600 nm(0.6±0.02),5000 r/min離心5 min,棄上清,菌體用5 mL無(wú)菌水重懸菌體并饑餓處理2 h。分別點(diǎn)接2 μL饑餓處理的細(xì)胞懸液到分別含0%、0.1%、0.3%、0.5%和1%的葡萄糖的YNBS平板上,28 ℃靜置培養(yǎng)3 d后,用碘熏蒸法觀察和測(cè)量透明圈的大小,以此判斷α-淀粉酶活力的大小。

1.2.4 葡萄糖對(duì)SΔcar1/A1、SΔcar1/A2在液體YPGS培養(yǎng)基中產(chǎn)α-淀粉酶的影響 接種SΔcar1/A1、SΔcar1/A2在含0%、0.1%、0.3%、0.5%、1%(w/v)葡萄糖的YPGS培養(yǎng)基,28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)至24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和84 h后,發(fā)酵上清中的α-淀粉酶活性用殘余淀粉的量表示,分析方法參考文獻(xiàn)[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad prism 6軟件處理上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Saccharomycopsis fibuligera ALP1編碼序列(alp1)的擴(kuò)增

以扣囊腹膜酵母基因組為模板,分別用ALP1a-L/R、ALP1-L/R為引物擴(kuò)增淀粉酶編碼序列alp1,擴(kuò)增子的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,已成功擴(kuò)增1500 bp左右的alp1。alp1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 Saccharomycopsis fibuligera alp1的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR products of alp1 from Saccharomycopsis fibuligera注:M. DL-2000 plus Marker;泳道1.ALP1a-L/R 引物擴(kuò)增alp1基因;泳道2.ALP1-L/R引物擴(kuò)增alp1基因。

2.2 pADH1/alp1和pADH2/alp1表達(dá)載體構(gòu)建

分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NcoⅠ酶切alp1和載體pADH1,二者通過(guò)T4連接酶連接構(gòu)建pADH1/alp1表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2 所示。由圖2可以看出,以pADH1/alp1為模板,分別用ALP1a-L/R及Adyz-L/R引物擴(kuò)增得到了1500 bp和2400 bp的條帶(圖2A)。同時(shí),XhoⅠ、NcoⅠ雙酶切pADH1/alp1,得到了1500 bp及7200 bp的條帶(圖2B),與預(yù)期結(jié)果一致。這說(shuō)明pADH1/alp1表達(dá)載體已成功構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶SalⅠ、KpnⅠ酶切alp1和pADH2,二者回收純化后用T4 連接酶連接構(gòu)建pADH2/alp1載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2所示。由圖2可以看出,以pADH2/alp1為模板,用ALP1-L/R引物擴(kuò)增得到1500 bp片段(圖2C)。對(duì)載體進(jìn)行PCR及SalⅠ、KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證,得到了1500及6000 bp片段(圖2D),與預(yù)期大小一致。這說(shuō)明pADH2/alp1表達(dá)載體已成功構(gòu)建。

圖2 表達(dá)載體pADH1/alp1和pADH2/alp1的PCR和雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Verification of pADH1/alp1 and pADH2/alp1 by PCR and enzyme digestion

2.3 pADH1/alp1和pADH2/alp1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化SΔcar1、篩選和鑒定

將構(gòu)建的pADH1/alp1和pADH2/alp1α-淀粉酶表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母SΔcar1,在以淀粉為唯一碳源的YNBS培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)7 d后用碘熏蒸,觀察透明圈,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 碘熏蒸法篩選YNBS平板上的SΔcar1/A1 和SΔcar1/A2轉(zhuǎn)化子Fig.3 Selection of SΔcar1/A1 and SΔcar1/A2 transform ants on YNBS by iodine fumigation

分別從長(zhǎng)有SΔcar1/A1及SΔcar1/A2的YNBS篩選平板上挑取菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示。兩株轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增得到了1500 bp左右的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。由此可證明兩種α-淀粉酶表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)化到SΔcar1中。

圖4 SΔcar1/A1及SΔcar1/A2的PCR驗(yàn)證Fig.4 PCR verification of SΔcar1/A1 and SΔcar1/A2注:M. DL-2000 plus Marker;泳道1.SΔcar1/A1轉(zhuǎn)化子 菌落PCR驗(yàn)證;泳道2.SΔcar1/A2轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證。

2.4 葡萄糖對(duì)SΔcar1/A1和SΔcar1/A2表達(dá)α-淀粉酶的影響

2.4.1 葡萄糖對(duì)SΔcar1/A1和SΔcar1/A2在YNBS固體培養(yǎng)基上產(chǎn)α-淀粉酶的影響 為了對(duì)比分析ADH1與ADH2啟動(dòng)子表達(dá)淀粉酶的效率以及葡萄糖對(duì)其影響,分別將SΔcar1、SΔcar1/A1和SΔcar1/A2等量點(diǎn)接在含有不同葡萄糖濃度的YNBS平板,28 ℃培養(yǎng)3 d后進(jìn)行碘熏蒸,并觀察和測(cè)量透明圈產(chǎn)生情況,結(jié)果如圖5和表 2 所示。由圖5和表2可以看出,SΔcar1/A1產(chǎn)生的透明圈直徑隨著葡萄糖濃度的增加而逐漸增大,在含0%、0.1%、0.3%、0.5%和1%(w/v)的葡萄糖的YNBS培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈直徑分別為0、12、15、16和17 mm。在不含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d時(shí),SΔcar1/A1僅出現(xiàn)微弱紫色暈圈,這說(shuō)明SΔcar1/A1 生長(zhǎng)不良,產(chǎn)α-淀粉酶低,但葡萄糖濃度增加,菌體生長(zhǎng)良好,產(chǎn)酶量增加。SΔcar1/A2產(chǎn)生的透明圈直徑隨葡萄糖濃度的增加先增大后減小,在含0%、0.1%、0.3%、0.5%和1%(w/v)的葡萄糖的YNBS培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈直徑分別為17、25、22、20、17 mm。這說(shuō)明SΔcar1/A2在不含葡萄糖的培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)和產(chǎn)酶,但其產(chǎn)酶量比在含葡萄糖的培養(yǎng)基上的低。然而,隨著葡萄糖濃度的繼續(xù)增加,淀粉酶的表達(dá)量又降低,這可能是因?yàn)樵跓o(wú)葡萄糖情況下菌株初始生長(zhǎng)受到影響,但高濃度的葡萄糖會(huì)降低SΔcar1/A2中淀粉酶的表達(dá)。鑒于此,SΔcar1/A1表達(dá)淀粉酶是需要葡萄糖誘導(dǎo),且葡萄糖濃度越高,酶表達(dá)量越高,而SΔcar1/A2表達(dá)淀粉酶則不需葡萄糖誘導(dǎo),但低濃度的葡萄糖有利于提高其產(chǎn)酶。然而過(guò)高濃度的葡萄糖又會(huì)使SΔcar1/A2淀粉酶的表達(dá)量減少。因此在使用不同菌株表達(dá)淀粉酶時(shí),應(yīng)在培養(yǎng)基中分別加入各自適量的葡萄糖濃度。此外,在含有1%(w/v)葡萄糖的培養(yǎng)基上,SΔcar1/A1和SΔcar1/A2產(chǎn)生的透明圈直徑相同(17 mm),但是在葡萄糖濃度為0%、0.1%、0.3%和0.5%時(shí),SΔcar1/A2的透明圈直徑都比SΔcar1/A1的大。這說(shuō)明SΔcar1/A2產(chǎn)α-淀粉酶的能力比SΔcar1/A1的強(qiáng)。

圖5 葡萄糖對(duì)SΔcar1/A1和SΔcar1/A2在YNBG平板上產(chǎn)α-淀粉酶影響Fig.5 Effect of glucose on the α-amylase of SΔcar1/A1 and SΔcar1/A2 on YNBG agar plate

葡萄糖濃度(w/v)透明圈直徑(mm)SΔcar1SΔcar1/A1SΔcar1/A2000170.1%012250.3%015220.5%016201%01717

2.4.2 葡萄糖對(duì)SΔcar1/A1、SΔcar1/A2在YPGS液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化淀粉能力的影響 對(duì)比分析

葡萄糖對(duì)SΔcar1/A1、SΔcar1/A2在液體YPGS培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化淀粉能力的影響,結(jié)果如圖6所示。在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中,SΔcar1/A1菌株不產(chǎn)α-淀粉酶,不分解淀粉,而在含有葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時(shí),該菌株不水解淀粉,但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),菌株開(kāi)始水解淀粉,且隨著葡萄糖濃度的增加,水解淀粉的能力增加(圖6A),這說(shuō)明SΔcar1/A1產(chǎn)生淀粉酶是需要葡萄糖誘導(dǎo)的,且隨著葡萄糖濃度增大,產(chǎn)酶量增加。SΔcar1/A2菌株則在不含葡萄糖和含葡萄糖培養(yǎng)基中都能轉(zhuǎn)化淀粉,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),淀粉水解能力增強(qiáng),但SΔcar1/A2α-淀粉酶表達(dá)受葡萄糖的反饋抑制,隨著葡萄糖濃度增加,淀粉水解速率稍有下降(圖6B),這說(shuō)明葡萄糖對(duì)SΔcar1/A2產(chǎn)酶具有反饋抑制作用。同時(shí),從圖6A和6B結(jié)果對(duì)比可以看出,在液體培養(yǎng)基中,SΔcar1/A2轉(zhuǎn)化淀粉的能力比SΔcar1/A1菌株的強(qiáng),更適合于液體培養(yǎng)基中淀粉的水解。

圖6 SΔcar1/A1和SΔcar1/A2在不同含糖量的YPGS培養(yǎng)基中發(fā)酵的淀粉殘余變化Fig.6 Starch residual curve of SΔcar1/A1 and SΔcar1/A2 during cultured in YPGS medium with different sugar concentration.注:A. SΔcar1/A1;B. SΔcar1/A2。

3 結(jié)論

本研究已成功構(gòu)建可產(chǎn)α-淀粉酶而低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的兩株酵母菌SΔcar1/A1和SΔcar1/A2。SΔcar1/A1在固體和液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生淀粉酶時(shí),都需要葡萄糖的誘導(dǎo),且隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加,酶的表達(dá)量增加。SΔcar1/A2在兩種培養(yǎng)基中產(chǎn)生淀粉酶時(shí)則不需葡萄糖誘導(dǎo),但SΔcar1/A2α-淀粉酶表達(dá)受葡萄糖的反饋抑制,在含葡萄糖的培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶量雖然比在不含葡萄糖的培養(yǎng)基上的高,但是過(guò)高的葡萄糖濃度也會(huì)降低其淀粉酶的表達(dá)。同時(shí),SΔcar1/A2產(chǎn)α-淀粉酶和水解淀粉的能力比SΔcar1/A1的強(qiáng)。綜上所述,SΔcar1/A2可以作為可水解淀粉且低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的菌種用于生料發(fā)酵,然而,對(duì)于SΔcar1/A2在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用則有待于進(jìn)一步研究。

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