大蒜汁對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌食品 分離菌株的生長(zhǎng)和生物被膜形成的影響

賀蘇皖,龍 虎,王洪志,杜 玄,田萬帆,唐俊妮

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

金黃色葡萄球菌是引起人類感染和食物中毒的常見病原菌,特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin resistantStaphylococcusaureus,簡(jiǎn)稱MRSA)。MRSA菌株于20世紀(jì)60年代開始被報(bào)道,當(dāng)時(shí)是作為重要的醫(yī)院病原菌出現(xiàn),但是在20世紀(jì)80年代末和90年代初,MRSA開始作為社區(qū)相關(guān)感染的重要病原菌出現(xiàn)在大洋洲區(qū)域,隨后遍布全世界。近年來,MRSA的流行在不斷改變,MRSA在食品動(dòng)物中的緊急出現(xiàn)已經(jīng)引起了人們對(duì)食品中MRSA存在的巨大關(guān)注[1-2]。由此可以看出,MRSA菌株對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅,特別是β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用,MRSA菌株的多重耐藥是目前存在的嚴(yán)重問題[3]。另一方面,生物被膜的形成給細(xì)菌提供了一個(gè)穩(wěn)定的生存環(huán)境,MRSA菌株具有形成生物被膜的能力,從而使得細(xì)菌具有更強(qiáng)的抵抗能力,非常難以消除[4]。

大蒜為多年生草本植物,具有多種藥理作用[5]。大蒜提取物中的活性成分能夠進(jìn)入致病菌的細(xì)胞質(zhì),干擾細(xì)菌的正常代謝,對(duì)致病菌有抑制和殺滅作用[6]。針對(duì)大蒜抑菌的相關(guān)研究主要集中在常見致病菌以及大蒜素的提取工藝上[7]?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為大蒜汁對(duì)大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌等均有良好抑制作用[8-9]。還有少量研究表明紫皮蒜的抑制效果優(yōu)于白皮蒜,但未見大蒜汁針對(duì)食品源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌研究。

為了尋求對(duì)抗MRSA的有效方法,本研究試圖探討兩種不同種類的大蒜汁對(duì)MRSA菌株的抑制活性以及對(duì)其生物被膜形成能力的影響,以期為MRSA的防控提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌食品分離菌株(MRSA-1、MRSA-2、MRSA-3、MRSA-4、MRSA-5、MRSA-6、MRSA-7) 由本實(shí)驗(yàn)室保存和鑒定(備注:采用mecA基因引物擴(kuò)增從食品中分離的金黃色葡萄球菌出現(xiàn)陽性條帶并測(cè)序比對(duì)正確認(rèn)定為MRSA菌株);普通白皮蒜和紫皮獨(dú)頭蒜 均產(chǎn)自成都本地(無芽新鮮)成都市某菜市場(chǎng);大豆酪蛋白瓊脂肉湯(TSB)和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA) 青島海博生物技術(shù)有限公司;結(jié)晶紫 上海優(yōu)選生物科技有限公司。

5804R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;UV-6100分光光度計(jì) 上海美普達(dá)公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱GHP-9270 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;96孔板 中國(guó)Costar公司;榨汁機(jī)JS30-230 浙江紹興蘇泊爾電器有限公司;pHS-4C+酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;Elx808酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-TEK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜汁制備 取一定量的新鮮白皮蒜和紫皮蒜分別剝皮,無菌水沖洗干凈,分別榨汁處理后,3000 r/min離心3 min,取大蒜原汁上清,分裝于不同的無菌EP管中并做好標(biāo)記,置于-20 ℃條件下保存、備用。

1.2.2 菌懸液制備 將保存的7株MRSA菌株的原始培養(yǎng)液各取50 μL分別接種于5 mL的TSB培養(yǎng)基中,將過夜培養(yǎng)的菌液分別劃線接種于TSA平板,(36±1) ℃過夜培養(yǎng)。分別挑取7株MRSA菌株的單菌落于不同管分裝的無菌生理鹽水中,調(diào)整菌懸液的濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?備用。

1.2.3 平板抑菌實(shí)驗(yàn) 使用無菌棉簽將調(diào)整好濁度的菌懸液均勻涂布于TSA平板上,每種大蒜汁樣品針對(duì)每株菌做三組平行。無菌條件下打孔,每個(gè)平板打三個(gè)孔,每孔加入20 μL大蒜汁,(36±1) ℃過夜培養(yǎng)16 h,取出測(cè)量抑菌圈直徑,結(jié)果取三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD表示。判定標(biāo)準(zhǔn)[10]:極敏:抑菌圈直徑>19 mm;高敏:抑菌圈直徑15～18 mm;中敏:抑菌圈直徑11～14 mm;低敏:抑菌圈直徑<11 mm。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI 2012)所推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)[11],進(jìn)行兩種蒜汁對(duì)7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌食品分離菌株的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)過夜的菌液按1∶100接種到96孔板中,使得細(xì)菌的接種濃度約為1.5×105CFU/mL。采用二倍稀釋法,白皮蒜汁的添加終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25 μL/mL以及對(duì)照組;參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,預(yù)實(shí)驗(yàn)中得知6.25 μL/mL的紫皮蒜汁已經(jīng)能夠有效抑制MRSA細(xì)菌的生長(zhǎng),所以,紫皮蒜汁的添加濃度分別設(shè)置為50、25、12.5、6.25、3.125 μL/mL以及對(duì)照組。每個(gè)濃度梯度做3個(gè)平行,同時(shí)設(shè)置空白組。實(shí)驗(yàn)組中加入160 μL的TSB、20 μL菌液及各稀釋濃度的大蒜汁(總體積為200 μL),對(duì)照中用20 μL的無菌水代替大蒜汁,空白組中加200 μL的TSB。(36±1) ℃培養(yǎng)16 h,觀察能夠抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的最低濃度作為各自的最小抑菌濃度MIC,用酶標(biāo)儀在630 nm處測(cè)定吸光度,并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 對(duì)生物被膜的影響實(shí)驗(yàn) 96板定量測(cè)定法[12]:兩種大蒜汁分別設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,各3個(gè)平行。對(duì)照組每孔分別加入180 μL的TSB和20 μL菌液,空白組中加入200 μL的TSB,實(shí)驗(yàn)組中加入及160 μL的TSB和20 μL菌液及不同濃度的大蒜汁(總體積為200 μL),大蒜汁的終濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC。37 ℃培養(yǎng)48 h。移除浮游菌體,加入200 μL磷酸緩沖液洗滌3次,加入100 μL甲醇固定15 min,并棄去殘液,晾干。加入2%結(jié)晶紫100 μL室溫染色5 min,棄多余染液,自來水洗滌至無色水滴,(36±1) ℃放置30 min,徹底干燥。加入33%的冰乙酸溶液100 μL,溶解吸附的細(xì)胞和結(jié)晶紫,用酶標(biāo)儀在630 nm處測(cè)定其吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel及SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,運(yùn)用單因素方差分析法比較各組及組間差別,p<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

兩種大蒜汁抑菌圈直徑大小見表1,由表1可以看出,白皮蒜汁對(duì)7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性,抑菌圈大于19 mm。從表1也可以看出,紫皮蒜汁對(duì)7株MRSA的抑菌能力更強(qiáng),抑菌圈均大于19 mm,屬于極敏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明兩種不同蒜汁都能很好地抑制7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),分析原因可能是生蒜中的大蒜素抑制了微生物生長(zhǎng)繁殖所依賴的巰基酶活性,從而使細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)不到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,起到有效抑制細(xì)菌的作用[13]。同時(shí)紫皮蒜汁與白皮蒜汁對(duì)7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌能力上存在顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

表1 兩種大蒜汁對(duì)7株MASR抑菌圈直徑大小(mm)Table 1 The bacteriostatic circle diameters of two types of garlic juices on the growth of MRSA isolates(mm)

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定結(jié)果

采用96孔板法測(cè)定兩種大蒜汁對(duì)7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度,結(jié)果見圖1和圖2。圖1表明:隨著大蒜汁濃度的增加,培養(yǎng)液在630 nm處的吸光度值下降,在12.5 mL/L濃度處,96孔板培養(yǎng)液的吸光度值是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn),因此,本實(shí)驗(yàn)中,把白皮蒜汁對(duì)7株MRSA菌株的最小抑菌濃度定為12.5 mL/L;同樣,從圖2可以看出紫皮蒜汁對(duì)7株MRSA菌株的最小抑菌濃度為6.25 mL/L。通過比較可以看出,紫皮蒜汁的抑菌活性強(qiáng)于白皮蒜汁,紫皮蒜的抑菌效果更好。

圖1 不同濃度白皮蒜汁對(duì)MRSA抑菌活性的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Antibacterial test against MRSA isolates by using different concentration of white garlic juices

圖2 不同濃度紫皮蒜汁對(duì)MRSA抑菌活性的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Antibacterial test against MRSA isolates by using different concentration of purple garlic juices

2.3 兩種大蒜汁對(duì)7株MRSA被膜形成影響測(cè)定結(jié)果

采用96孔板法定量觀察兩種大蒜汁對(duì)7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌被膜形成的影響結(jié)果見圖3和圖4。由圖3可以看出,與對(duì)照相比,添加不同亞抑菌濃度的大蒜汁,7株MRSA菌株的生物被膜含量明顯較低,曲線呈下降趨勢(shì)。隨著大蒜汁濃度的增加,生物膜的含量逐漸減少,說明白皮蒜汁對(duì)7株MRSA的生物被膜形成具有明顯抑制作用;圖4是加入紫皮蒜汁所得7株MRSA菌株的生物被膜含量變化圖,由圖4也可以看出,隨著紫皮蒜汁濃度的增加,7株MRSA菌株的生物被膜含量也明顯減少,并且細(xì)菌生物被膜的形成能力與大蒜汁的添加濃度呈負(fù)相關(guān),可見,適當(dāng)添加一定濃度的大蒜汁可以很好抑制MRSA細(xì)菌的生物被膜形成。

圖3 白皮蒜汁在不同抑菌濃度下對(duì)7株MRSA生物被膜形成的影響結(jié)果Fig.3 The effect of white garlic juice on MRSA biofilm formation at different sub inhibitory concentration

圖4 紫皮蒜汁在不同抑菌濃度下對(duì)7株MRSA生物被膜形成的影響結(jié)果Fig.4 The effect of purple garlic juice on MRSA biofilm formation at different sub inhibitory concentration

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中,兩種不同大蒜汁對(duì)7株MRSA食品分離菌株均有明顯的抑菌活性,抑菌圈的直徑范圍高于19 mm,屬于極敏,抑制率達(dá)到了100%。

紫皮蒜汁的MIC值為6.25 mL/L,白皮蒜汁的MIC為12.5 mL/L,紫皮蒜汁和白皮蒜汁對(duì)7株MRSA的抑菌效果存在顯著差異(p<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相同濃度的紫皮蒜抑菌效果更好。

在不同亞抑菌濃度大蒜汁的干預(yù)下,7株MRSA產(chǎn)生的生物被膜含量均顯著減少,適當(dāng)?shù)奶砑由笏庵軌蚝芎靡种芃RSA菌株生物被膜的形成。

4 討論

金黃色葡萄球菌是一個(gè)大家都知曉的病原菌,在環(huán)境中廣泛存在,是造成皮膚和軟組織感染,心內(nèi)膜炎和菌血癥以及食物中毒的主要原因[14]。目前出現(xiàn)了耐藥性金黃色葡萄球菌的廣泛傳播和流行,甚至是暴發(fā)流行。其中最為嚴(yán)重的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),其引發(fā)的感染難以控制,且近年來檢出率呈增高趨勢(shì)[15]。MRSA菌株不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥,還對(duì)喹諾酮類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物耐藥。因此,預(yù)防和控制MRSA菌株是目前面臨的重要難題[16-17]。另一方面,細(xì)菌生物被膜的存在,大大增加了細(xì)菌的耐藥性。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)外界環(huán)境而分泌的多糖基質(zhì)、纖維蛋白等構(gòu)成胞外基質(zhì),將其自身包裹其中而形成的一種細(xì)菌聚集物。生物被膜的形成為細(xì)菌提供了一個(gè)保護(hù)性的生活環(huán)境,并屏蔽了寄主的免疫功能,使得細(xì)菌能夠大量增殖、擴(kuò)散,也是細(xì)菌反復(fù)感染的重要原因[18]。正是基于目前采用抗生素對(duì)付MRSA菌株存在一定的難度,本研究試圖探索其它途徑控制MRSA菌株。我們采用兩種不同品種的生大蒜汁對(duì)7株MRSA食品分離MRSA菌株進(jìn)行研究,通過觀察大蒜汁的抑菌效果及對(duì)MRSA細(xì)菌生物被膜的形成影響來評(píng)價(jià)大蒜汁在控制MRSA上的應(yīng)用,旨在為食品中MRSA菌株的控制策略提供一定參考。

大蒜殺菌和抑菌主要活性成分是大蒜素及一些揮發(fā)性硫醚化合物,大蒜汁對(duì)其他病原菌的殺菌效果已有探討,但針對(duì)MRSA菌株的研究目前還比較少。本實(shí)驗(yàn)通過研究?jī)煞N不同種類的大蒜汁對(duì)MRSA菌株生長(zhǎng)及其生物被膜形成影響,發(fā)現(xiàn)紫皮蒜汁的抑菌效果更好,推測(cè)紫皮蒜中所含的大蒜素等抑菌成分比白皮蒜更豐富。我們的結(jié)果與倪萍等[19]的結(jié)果一致,他們的研究也認(rèn)為紫皮蒜針對(duì)蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性比白皮蒜更強(qiáng)。

在細(xì)菌生物被膜的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,我們的結(jié)果表明在不同亞抑菌濃度大蒜汁的干預(yù)下,7株MRSA產(chǎn)生的生物被膜量均顯著減少。分析其原因,一方面可能是大蒜汁抑制了細(xì)菌本身的生長(zhǎng),另一方面大蒜汁中的大蒜素也可抑制細(xì)菌胞外多糖的分泌,減少細(xì)菌粘附性,干擾細(xì)菌生物被膜的成熟和分化,大蒜素濃度越高,抑制效果越明顯[20]。因此,在日常生活中,涼拌食品中添加一定濃度的大蒜汁可以起到有效抑制MRSA菌株的生長(zhǎng)和生物被膜的形成。

綜上,本研究結(jié)果表明兩種不同大蒜汁對(duì)MRSA菌株的生長(zhǎng)和細(xì)菌生物被膜的形成均具有明顯抑制效果。本研究結(jié)果為探索抑制超級(jí)細(xì)菌MRSA的研究提供參考,也對(duì)人們?nèi)粘Ｉ罹哂泻芎玫闹笇?dǎo)意義。

[1]Wang W,Liu F,Baloch Z,et al. Genotypic characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureusisolated from pigs and retail foods in China[J]. Biomed Environ Sci,2017,30(8):570-580.

[2]Iqbal Z,Seleem MN,Hussain HI,et al. Comparative virulence studies and transcriptome analysis ofStaphylococcusaureusstrains

isolated from animals[J]. Sci Rep,2016,6:35442.

[3]黃德斌,胡澤華,余昭芬,等. 馬桑水提取物抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制研究[J].中草藥,2017,48(9):1802-1811.

[4]邢茜,江榮林,雷澍,等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究進(jìn)展[C].全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合重癥醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議,2013:3638-3640.

[5]李建濤,劉書深,劉姝瑋,等.大蒜浸提液的抑菌效應(yīng)[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2017(1):65-66.

[6]李巖,呂昌龍,桑力軒,等.黑大蒜提取物聯(lián)合抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的體外抗菌作用研究[J].微生物學(xué)雜志,2014,34(2):59-62.

[7]王晨旭,來平煜,李悅,等.大蒜素的提取工藝[J].甘肅科技,2017,33(1):44-47.

[8]尚叢珊,于乾,馮霞霞.大蒜提取液抑菌效果的研究[J].科技展望,2017,27(9):1672-8289.

[9]Saha SK,Saha S,Akhter SM,et al.InVitrodetermination of minimum inhibitory concentration of aqueous garlic extract and imipenem againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoli[J].Mymensingh Med J,2016,25(3):477-84.

[10]姜成,申曉慧,李春豐,等.大蒜對(duì)常見食品污染細(xì)菌的抑制作用研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(7):113-116.

[11]唐俊妮,王瓊,韋吉敏,等. 洋蔥汁對(duì)五種常見食源性病原細(xì)菌抑菌效果研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2015,41(3):277-284.

[12]朱安妮,袁寧,唐俊妮,等. 鮮榨檸檬原汁對(duì)7種常見食源性致病菌抑菌效果及被膜形成的影響[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2016,28(1):16-22.

[13]蘇鳳賢,張寶善.大蒜素的殺菌及其在食品中的防腐保鮮應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品,2006(6):13-17.

[14]Ma YSL,Zhao YY,Tang JN,et al. Antimicrobial susceptibility and presence of resistance & enterotoxins/enterotoxin-likes genes inStaphylococcusaureusfrom food[J]. CyTA-Journal of Food,2018,16(1):76-84.

[15]Sato T,Usui M,Konishi N,et al. Closely related methicillin-resistantStaphylococcusaureusisolates from retail meat,cows with mastitis,and humans in Japan[J].PLoS One,2017,12(10):e0187319.

[16]朱吉超,魏蓮花,楊永清,等. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床分布及耐藥性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2017,27(7):1462-1465.

[17]陳斌澤,李澤慧,馮強(qiáng)生,等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥機(jī)制與分子分型研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,13(19):2824-2827.

[18]王瓊,唐俊妮,陳娟,等.金黃色葡萄球菌生物被膜檢測(cè)及控制方法研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2014,35(22):71-375.

[19]倪萍,劉素輝,牛婷婷,等.紫皮蒜和白皮蒜抑菌活性的比較研究[J].醫(yī)學(xué)信息,2013(16):126-126.

[20]林麗華.大蒜素對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的干預(yù)作用及機(jī)制初步研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué),2009.