高濃度培養(yǎng)乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

吳軍林,柏建玲,莫樹(shù)平,張菊梅

(1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,廣東廣州 510643;2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070)

乳酸菌(Lactic acid bacteria LAB)是指一群利用可發(fā)酵性碳水化合物,產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱(chēng)[1]。乳酸菌是一類(lèi)對(duì)人體有益的微生物菌群,廣泛分布在自然界。乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、醇類(lèi)及各種氨基酸等代謝物,具有抑制腐敗菌、提高消化率、防癌等生理功效[2]。高密度培養(yǎng)沒(méi)有確切的定義,是一個(gè)相對(duì)概念,指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度,使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著的提高,最終提高特定產(chǎn)物的比生產(chǎn)率[3]。這種培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)在于縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本,能極大提高產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[4]。

乳酸菌要通過(guò)高密度培養(yǎng)技術(shù)達(dá)到理想的高濃度產(chǎn)量,需要優(yōu)化一系列相關(guān)的工藝參數(shù)來(lái)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格的控制[5]。通過(guò)解決這些問(wèn)題,設(shè)計(jì)出合適的培養(yǎng)途徑達(dá)到理想的菌體濃度。研究報(bào)道表明,影響乳酸菌增殖的因素有很多,如菌種的活力、培養(yǎng)代數(shù)、培養(yǎng)周期、培養(yǎng)液的初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、增殖因子等,其中培養(yǎng)基的物理性質(zhì)及成分會(huì)嚴(yán)重影響到乳酸菌菌體的收集工作,所以培養(yǎng)基的選擇多選用粘度小、蛋白質(zhì)含量低的透明液[6]。另外培養(yǎng)基選擇合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適當(dāng)濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是達(dá)到菌體高密度的重要途徑之一[7]。

本文根據(jù)乳桿菌R8菌的特性,篩選了最優(yōu)的碳源和氮源,對(duì)培養(yǎng)基碳氮量及碳氮比、微量元素、緩沖體系、組分構(gòu)成比例進(jìn)行了優(yōu)化,確定適宜R8菌高密度培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳桿菌R8 由廣東省微生物研究所檢測(cè)新技術(shù)組篩選馴化提供[8]；MRS培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

SIGMA 3K15臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV-1800全波長(zhǎng)掃描分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 培養(yǎng)基制備 MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0 g,胰蛋白胨10.0 g,牛肉膏8.0 g,酵母粉4.0 g,Tween80 1.0 mL,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g,檸檬酸銨2.0 g,CH3COONa·3H2O 5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH6.2。

液體種子及發(fā)酵培養(yǎng)基—改良MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0 g,酵母粉30.0 g,MgSO4·7H2O 2.0 g,KH2PO42.5 g,檸檬酸三銨2.5 g,CH3COONa·3H2O 6.25 g,Tween80 1.0 mL,pH6.2。平板計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基：改良MRS液體培養(yǎng)基加1.5%～2%瓊脂。

1.2.1.2 菌種保存 乳桿菌R8菌株于甘油管中-20 ℃保存。

1.2.1.3 液體種子培養(yǎng) 取凍存的R8菌株,按2%的接種量接種于改良MRS培養(yǎng)基(100 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶),37 ℃培養(yǎng)16 h。

1.2.1.4 液體發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液按2%接種量接種于改良MRS培養(yǎng)基(50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶),37 ℃培養(yǎng)20 h[8-9]。

1.2.2 培養(yǎng)基碳源及氮源的篩選 在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變氮源等其它成分，分別采用不同的碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、低聚麥芽糖、可溶性淀粉)和在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變碳源等其它成分，分別采用不同的氮源(胰蛋白胨、酵母粉、麥芽提取物、大豆蛋白胨、牛肉膏、(NH4)SO4、KNO3)配制培養(yǎng)基，接種發(fā)酵，測(cè)定菌液OD600值，確定最佳的碳源及氮源。

1.2.3 培養(yǎng)基碳氮量及碳氮比的優(yōu)化 在確定了最佳碳源及氮源后,在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,選擇0.5∶1、1.0∶1、2.0∶1、3.0∶1的碳氮比配置培養(yǎng)基[10],接種發(fā)酵,測(cè)定菌液OD600值,確定適宜的碳氮量及碳氮比。

1.2.4 培養(yǎng)基微量元素的優(yōu)化 以?xún)?yōu)化的碳氮源的培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別添加不同量的不同微量元素(MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·4H2O 0.075 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl20.1 g/L)[10],以不添加微量元素作參照,接種發(fā)酵,測(cè)定菌液OD600值,確定微量元素的種類(lèi)及用量。

1.2.5 培養(yǎng)基緩沖體系的優(yōu)化 以?xún)?yōu)化了碳氮源及微量元素的培養(yǎng)基為基礎(chǔ),不同種類(lèi)的緩沖體系(Na2HPO4/NaH2PO4、K2HPO4/KH2PO4、Na2HPO4/KH2PO4、檸檬酸/檸檬酸鈉、Na2HPO4/檸檬酸、檸檬酸銨/乙酸鈉/KH2PO4)分別以不同濃度(0.00、0.02、0.04、0.08、0.10mol/L)添加,以不添加緩沖體系的培養(yǎng)基為對(duì)照,接種發(fā)酵,測(cè)定菌液OD600值,確定最優(yōu)的緩沖體系。

1.2.6 培養(yǎng)基組分構(gòu)成比例優(yōu)化 通過(guò)培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)確定了適合R8菌生長(zhǎng)的碳氮源、微量元素及緩沖體系,設(shè)計(jì)三因素兩水平考慮交互作用的正交實(shí)驗(yàn),以菌液的OD600值作為響應(yīng)值,碳源含量(X1)、氮源含量(X2)、緩沖鹽含量(X3)為自變量,實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 三因素二水平設(shè)計(jì)表Table 1 Three factors and two levels used in orthogonal test design

1.2.7 檢測(cè)方法

1.2.7.1 發(fā)酵液菌體干重測(cè)定 取一定體積的發(fā)酵液,8000 r/min離心10 min后用無(wú)菌水洗滌兩次,再將菌體60 ℃干燥后稱(chēng)重,即可算得菌體干重,以g/L表示。

1.2.7.2 發(fā)酵液濃度測(cè)定 取一定體積培養(yǎng)液8000 r/min離心10 min,棄上清液,用等體積的無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次后將菌體懸浮,測(cè)定600 nm下的吸光度值。

1.2.7.3 菌液活菌數(shù)測(cè)定 菌液用梯度稀釋法稀釋到一定倍數(shù)后涂平板,37 ℃培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù),結(jié)果以cfu/mL表示[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源優(yōu)化

碳源是培養(yǎng)基主要成分之一,主要功能有兩方面:一是提供微生物菌體生長(zhǎng)繁殖所需的能源及合成菌體所需的碳骨架;二是為菌體合成目的產(chǎn)物提供原料。常用碳源有糖類(lèi)、油脂、有機(jī)酸和低碳醇等[11]。一般葡萄糖適合乳桿菌的生長(zhǎng)。熊濤[12]、隋春光[13]等對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)進(jìn)行研究,優(yōu)化碳源,發(fā)現(xiàn)葡萄糖是最佳碳源。本實(shí)驗(yàn)主要以不同的糖類(lèi)作為碳源進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果如表2所示。

表2 在不同碳源培養(yǎng)基中R8菌的 菌體密度Table 2 Absorbances of Lactobacillus R8 grown

表2顯示,不同的碳源對(duì)于R8的生長(zhǎng)影響顯著(p<0.01),其中葡萄糖和乳糖的菌液OD600值最高,表明R8菌對(duì)葡萄糖和乳糖的利用能力最強(qiáng),其次為果糖；蔗糖、可溶性淀粉利用能力較弱。故采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選出的碳源物質(zhì)為葡萄糖和乳糖,但二者之間無(wú)顯著性差異。因考慮成本(乳糖是葡萄糖價(jià)格的兩倍以上),選擇葡萄糖作為最佳碳源。

2.2 培養(yǎng)基氮源優(yōu)化

氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞和合成含氮代謝產(chǎn)物,主要包括有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源兩大類(lèi)[14]。本實(shí)驗(yàn)選擇了5種有機(jī)氮源和2種無(wú)機(jī)氮源進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果如表3。

表3 在不同氮源培養(yǎng)基中R8菌的 菌體密度Table 3 Absorbances of Lactobacillus R8 grown with different carbon and nitrogen

表3顯示,不同氮源對(duì)R8生長(zhǎng)的影響差異顯著(p<0.01),整體看有機(jī)氮源要優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源,這主要因?yàn)槿樗峋陨砻赶岛?jiǎn)單,許多氨基酸不能自身合成,需從外界攝取,有機(jī)氮源除了提供氮外,還含有豐富的氨基酸及維生素,更利于菌體的生長(zhǎng)[15]。從表3可得酵母粉的效果最好,大豆蛋白胨次之,其它幾種氮源效果相對(duì)較差,有許多對(duì)乳酸菌的研究都表明酵母粉是最適宜的氮源,如洪梅[16]、姚國(guó)強(qiáng)[10]等對(duì)不同乳桿菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最佳氮源都為酵母粉,因此選擇酵母粉作為最佳氮源。

2.3 培養(yǎng)基碳氮比優(yōu)化

培養(yǎng)基中的碳氮比例對(duì)微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的影響極為顯著[11]。氮源過(guò)量使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛,易引起菌體的衰老和自溶;碳源過(guò)量則易形成較低的pH,不利于菌體生長(zhǎng)[17]。不同碳氮量及碳氮比對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可看出培養(yǎng)基碳氮比例的不同對(duì)R8菌生長(zhǎng)影響顯著(p<0.01),從碳氮比例看,在0.5～1之間時(shí),菌體生長(zhǎng)相對(duì)較好,當(dāng)碳氮比大于1時(shí),菌體濃度明顯下降。從碳氮總量看,菌體濃度隨著碳氮總量的提高而升高,但總量為40 g/L和50 g/L時(shí),菌體濃度無(wú)顯著變化(p>0.01)。

圖1 不同碳氮量及碳氮質(zhì)量比對(duì)R8生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of total concentration of nitrogen and carbon and carbon/nitrogen ratio on the absorbance of Lactobacillus R8注：相同字母的數(shù)據(jù)之間差異不顯著(p>0.01)，不同字母的數(shù)據(jù)之間差異顯著(p<0.01)。

2.4 培養(yǎng)基微量元素的優(yōu)化

Fe,Mg,Mn,Zn,Ca等微量元素作為酶的激活劑或生物活性物質(zhì)的組成成分也是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中不可缺少的。這些物質(zhì)一般在低濃度時(shí)對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成有促進(jìn)作用,高濃度時(shí)則表現(xiàn)出明顯的抑制作用[11]。圖2顯示了分別在培養(yǎng)基中添加不同濃度的MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O,FeSO4·7H2O,ZnSO4·7H2O,CaCl2時(shí)R8的生長(zhǎng)情況。

圖2 Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+ 對(duì)R8生長(zhǎng)促進(jìn)作用比較Fig.2 Effects of different types of trace elements

由圖3可以看出與不添加微量元素相比,適量的添加一些微量元素有利于菌體的生長(zhǎng),當(dāng)添加超過(guò)一定量時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用會(huì)降低,而過(guò)量添加Zn2+會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。由圖3可看出Mn2+對(duì)菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯,MnSO4·4H2O的最適添加量為0.075 g/L,菌濃比對(duì)照組提高20.7%。Mn2+作為乳酸脫氫酶的組成成分,是促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子之一,已有報(bào)道利用L.casei發(fā)酵乳清水解物生產(chǎn)乳酸時(shí)需補(bǔ)充Mn2+以提高乳糖的利用率及乳酸產(chǎn)率[18]。其次是Mg2+,當(dāng)MgSO4·7H2O的最適添加量為2 g/L,菌濃比對(duì)照組提高15.5%?？紤]到糖酵解的大部分過(guò)程中都必須有Mg2+作為輔助因子,所以選擇添加Mn2+和Mg2+。

圖3 不同濃度的Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+對(duì)R8生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of trace elements(Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+)on absorbance of Lactobacillus R8

2.5 培養(yǎng)基緩沖體系的優(yōu)化

在培養(yǎng)基中添加緩沖鹽,一方面可調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓,另一方面主要是對(duì)發(fā)酵代謝產(chǎn)酸的細(xì)菌而言,添加緩沖鹽可以緩解乳酸造成的低pH對(duì)菌體的抑制作用。常用的緩沖體系有檸檬酸鹽、磷酸鹽和乙酸鹽等。不同緩沖體系對(duì)R8菌生長(zhǎng)影響結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可看出具有緩沖體系的培養(yǎng)基中的菌體濃度明顯要高于對(duì)照組,不同緩沖體系之間以及同一緩沖體系不同濃度之間的差異顯著(p<0.01),其中檸檬酸銨/乙酸鈉/KH2PO4緩沖體系最適于R8菌的生長(zhǎng)。

表4 在不同緩沖體系培養(yǎng)基中R8菌的菌體密度Table 4 Absorbance of Lactobacillus R8 in different buffered salt

2.6 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)基組分構(gòu)成比例

本研究采用三因素二水平的考慮交互作用的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基中主要成分(碳源、氮源、緩沖體系)的含量進(jìn)行優(yōu)化,以菌液濃度(OD600 nm)為響應(yīng)值確定出最適培養(yǎng)基配方,實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 考慮交互作用的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表Table 5 The orthogonal test design and results table considering interaction

對(duì)表5中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀(guān)分析,從不同因素所對(duì)應(yīng)的極差值可看出因素X2(酵母粉)對(duì)菌體濃度的影響最大,其次是因素X1(葡萄糖),再次是X3(緩沖鹽),三個(gè)因素間的交互作用對(duì)菌體濃度的影響不明顯。從表5中可得出優(yōu)化后的組合為X1(葡萄糖)20 g/L,X2(酵母粉)30 g/L,X3(緩沖鹽)1.0 mol/L。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 方差分析表Table 6 The variance analysis table

在表6中,X1X2,X1X3,X2X3的離差相對(duì)很小,說(shuō)明這三項(xiàng)的作用不顯著(p>0.01),將這三項(xiàng)并入誤差項(xiàng),并取誤差項(xiàng)的自由度為4相自由度之和,進(jìn)而算得均方離差及F值。由方差分析的結(jié)果可知葡萄糖,酵母粉和緩沖鹽對(duì)菌體的生長(zhǎng)具有顯著影響(p<0.01),而三種營(yíng)養(yǎng)成分之間的交互作用對(duì)菌體生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響(p>0.01)。經(jīng)過(guò)以上系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化,確定適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)為:葡萄糖20.0 g,酵母粉30.0 g,MnSO4·4H2O 0.075 g,MgSO4·7H2O 2.0 g,KH2PO42.5 g,檸檬酸銨2.5 g,CH3COONa·3H2O 6.25 g,Tween80 1.0 mL,pH6.2。菌體濃度(OD600 nm)達(dá)到2.38。

3 結(jié)論

針對(duì)前期篩選出的耐胃液耐膽汁菌株R8的營(yíng)養(yǎng)需求,對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及含量進(jìn)行系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化,確定適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖20.0 g,酵母粉30.0 g,MnSO4·4H2O 0.075 g,MgSO4·7H2O 2.0 g,KH2PO42.5 g,檸檬酸銨2.5 g,CH3COONa·3H2O 6.25 g,Tween80 1.0 mL,pH6.2。菌體濃度(OD600 nm)達(dá)到2.38。

乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸,使pH下降到菌體耐酸的極限,此時(shí)即使有充足的營(yíng)養(yǎng),菌體細(xì)胞的進(jìn)一步生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制[19-21]。因此僅提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還不夠,必須通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、排出代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)pH等措施,盡量減少和降低代謝產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制[22-25]。因此接下來(lái)需要對(duì)R8菌株的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等進(jìn)行深入研究,為該菌的后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

[1]楊潔彬,郭興華,張?bào)?等.乳酸菌-生物學(xué)基礎(chǔ)應(yīng)用[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1996:1-10.

[2]唐京,陳明,柯文燦,等.乳酸菌在疾病防治和人體保健中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2017,37(4):98-108.

[3]劉子宇,李平蘭,鄭海濤,等.微生物高密度培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)乳業(yè),2005(12):47-51.

[4]史媛英,肖冬光.酸奶發(fā)酵劑高濃度培養(yǎng)的研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),1999(1):20-25.

[5]Riesenberg D,Guthke R. High-cell-density cultivation of microorganisms[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1999,51(4):422-430.

[6]Tripathi P,Beaussart A,Andre G. Towards a nanoscale view of lactic acid bacteria[J].Food Chemistry,2012,43(12):1323-1330.

[7]陳堅(jiān).發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003:68-82.

[8]柏建玲,吳清平,張菊梅,等.耐胃液乳酸菌的篩選、鑒定與馴化[J].食品工業(yè)科技,2010,31(11):190-192,195.

[9]柏建玲,莫樹(shù)平,鄭婉玲,等.乳酸菌增菌培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)因子優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(2):79-81.

[10]姚國(guó)強(qiáng),張雪梅,高志敏,等.Lactobacillus ruuteri IMAU10240增殖培養(yǎng)基及高密度培養(yǎng)工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2017,38(14):97-105.

[11]韓德權(quán)編.微生物發(fā)酵工藝學(xué)原理[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2013:68-100.

[12]熊濤,黃錦卿,宋蘇華,等.植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及高密度培養(yǎng)技術(shù)[J].食品科學(xué),2011,32(7):262-268.

[13]隋春光,梁金鐘,王風(fēng)青.植物乳桿菌LP-S2高密度培養(yǎng)的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2016,12(8):49-53.

[14]馮慧杰,沐萬(wàn)孟,張濤,等.乳酸乳球菌的高密度發(fā)酵研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(14):197-201.

[15]俞俊棠,唐孝宣.生物工藝學(xué)[M].上海：華東理工大學(xué)出版社,1999:101-102.

[16]洪梅,刁其玉,閆貴龍,等.一株發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].飼料工業(yè),2010,31(19):26-29.

[17]黃宇,孫寶盛,孫井梅,等.枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),2007(3):180-183.

[18]高艷玲,郭明若.利用L.casei及L.lactis發(fā)酵乳清滲透液生產(chǎn)高純度L-乳酸[J].中國(guó)乳品工業(yè),2008,36(3):4-9.

[19]Thunell R K. Frozen starters from internal-Ph-contronal-grown-cultures[J].J of dairy sci，1984,67(1):24-36.

[20]史媛英,肖冬光.酸奶發(fā)酵劑高濃度培養(yǎng)的研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),1999(1):20-25.

[21]Ballongue J,Salminen S,Wright A,et al. Lactic acid bacteria microbiological and functional aspects[M].New York:Marcel Dekker Inc,2004:67-124.

[22]Janer C,Pelaez C,Requena T. Caseinomacropeptide and whyprotein concentrate enhance bifidobacterium lactis growth in milk[J].Food Chemistry,2004,86(2):263-267.

[23]Gonzalez R,Blancas A,Santillana R,et al. Growth and final product formation by bifidobacterium infantis in aerated fermentations[J].Applied and Environment Microbiology,2004,65(5):606-610.

[24]李旭華.乳酸細(xì)菌濃集條件的研究[D].西安:陜西科技大學(xué),2010.

[25]韋海陽(yáng),孫文敬,崔鳳杰,等.微生物高細(xì)胞密度培養(yǎng)技術(shù)及其在食品添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用,2013(2):204-213.