胃癌組織中Notch1、Notch2、COX-2的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

劉 敏，任 茜，李 強(qiáng)，葉玉偉，陳兆峰

1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省胃腸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

在中國(guó)，胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，每年新增36～40萬(wàn)胃癌患者，死亡率占我國(guó)腫瘤死因的第二位，而甘肅省為胃癌高發(fā)區(qū)，死亡率位居全國(guó)首位[1]。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是一種誘導(dǎo)型表達(dá)蛋白，催化花生四烯酸生成前列腺素，參與炎癥、腫瘤血管形成及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等多種病理生理過(guò)程。

1 材料與方法

1.1材料收集2010年4月至2012年6月于甘肅省武威市腫瘤醫(yī)院接受胃癌根治手術(shù)的65例患者的手術(shù)切除標(biāo)本，男40例，年齡(25～75)歲(中位年齡54歲)，女25例，年齡(28～76)歲(中位年齡55歲)。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：納入本研究患者均為武威地區(qū)常駐人口，術(shù)前均未接受過(guò)放、化療，無(wú)嚴(yán)重心、肺功能衰竭等疾病，既往無(wú)胃手術(shù)史。分別采集胃癌及其其癌旁組織，于-80 ℃長(zhǎng)期保存。所有患者收集完整的臨床及病理資料，包括姓名、性別、年齡、病變部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。

1.2試劑Total RNAiso Plus、SYBP?Premix Ex TaqTM Ⅱ、PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time、引物合成均來(lái)自TaKaRa公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bioworld公司、RIPA蛋白裂解液(強(qiáng))與PMSF購(gòu)自碧云天生物公司，Super ECL Plus超敏發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊公司。Anti-Notch1 intracell μLar domain antibody、Anti-Notch2 intracell μLar domain antibody 、Anti-COX-2 antibody均購(gòu)自Abcam公司、Anti-GAPDH antibody購(gòu)自杭州賢至生物。其余qPCR、Western blotting試劑與儀器均來(lái)自甘肅省胃腸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸/蛋白定量檢測(cè)儀進(jìn)行總RNA定量檢測(cè)，所提取的胃癌及其癌旁組織的OD260/OD280比值為1.8～2.2。按照5×PrimeScript RT Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBP?Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用LightCycler?480擴(kuò)增儀采用兩步法進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)步驟：95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量2-△△Ct公式比較目的基因在不同樣本中的差異。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。所使用的引物序列如表1所示。

表1 PCR引物Tab 1 PCR primers

1.4Westernblotting檢測(cè)配制分離膠、濃縮膠灌入并插入梳子，濃縮膠凝固后拔出。取20 μl變性后蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，取15 μl加入上樣孔中。80 V恒壓電泳半小時(shí)進(jìn)入，待溴酚藍(lán)分離膠后，120 V恒壓電泳1 h，以300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。室溫封閉2 h后移至一抗溶液(COX-2 1∶1 000，Notch1 1∶500，Notch2 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)4 ℃過(guò)夜。室溫下將清洗3次后移至二抗稀釋液(1∶2 000)中2 h。清洗后將膜放入暗盒并滴入發(fā)光液，曝光后將膠片置于顯影液及定影液中。以Image J軟件分析目標(biāo)條帶的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1Notch1、Notch2、COX-2mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)胃癌組織中，Notch1 mRNA的表達(dá)量低于相應(yīng)癌旁組織(0.45±0.3)倍，Notch2 mRNA高于相應(yīng)癌旁組織(3.35±1.4)倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COX-2 mRNA的表達(dá)在癌組織中高于癌旁組織(3.06±1.8)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)(見(jiàn)圖1)。

圖1 Notch1、Notch2、COX-2 mRNA在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)Fig 1 The mRNA expression of Notch1, Notch2,COX-2 in gastric cancer tissues and paracancerous tissues

2.2N1IC、N2IC、COX-2蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)及與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系胃癌組織中Notch1胞內(nèi)段(N1IC)的表達(dá)(0.26±0.4)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織(0.91±1.1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。N1IC的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、TNM分期有相關(guān)性(P<0.05)。Notch2 胞內(nèi)段(N2IC)在胃癌組織中(1.74±1.9)顯著高于相應(yīng)癌旁組織(0.98±1.4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。胃癌中N2IC的表達(dá)與浸潤(rùn)深度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05)。COX-2在胃癌組織中的表達(dá)(3.04±2.4)高于相應(yīng)癌旁組織(0.79±0.9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。胃癌組織中COX-2的表達(dá)與胃癌分化程度、浸潤(rùn)深度有相關(guān)性(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表2)。

2.3Notch1、Notch2、COX-2胃癌中表達(dá)的相關(guān)性分析Notch1、Notch2在胞內(nèi)分別以其活化形式N1IC、N2IC發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用。N1IC與COX-2在胃癌中呈負(fù)相關(guān)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.246,P=0.125)。N2IC與COX-2在胃癌中呈正相關(guān)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.33,P=0.037)。

3 討論

Notch信號(hào)通路廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡及分化影響組織和器官的正常發(fā)育；在遺傳進(jìn)化的過(guò)程中高度保守，與其他多個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一起構(gòu)筑起生物發(fā)展的信號(hào)骨架[2]。Notch信號(hào)不僅在胚胎正常發(fā)育的過(guò)程中廣泛表達(dá)，決定細(xì)胞分化的方向，在組織形成、個(gè)體發(fā)育、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等生理病理過(guò)程中也具有舉足輕重的作用[3]。

近年的研究顯示，Notch信號(hào)通路除了與多種實(shí)體瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)；Notch信號(hào)通路的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]；表明Notch信號(hào)在消化系統(tǒng)腫瘤的形成中也起到十分關(guān)鍵的作用，并在同一種腫瘤的不同類(lèi)型或不同發(fā)展階段中扮演著不同的角色，既可表現(xiàn)為致瘤性，又可表現(xiàn)為抑癌性[5-8]。大量研究[9-10]顯示，Notch1對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展在不同組織中可以起完全相反的作用，在腫瘤細(xì)胞的不同時(shí)期所起作用也可能不同。研究[11]發(fā)現(xiàn)，Notch1在宮頸癌發(fā)生早期階段為促癌作用，而晚期則表現(xiàn)為抑癌作用。本研究結(jié)果提示Notch1在胃癌中低表達(dá)，雖與COX-2呈反向表達(dá)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較小有關(guān)。Notch1是抑癌基因還是促癌基因由組織和細(xì)胞所處的體內(nèi)微環(huán)境所決定，這些微環(huán)境因素包括：細(xì)胞種類(lèi)、Notch1活化程度、Notch1與其他信號(hào)通路交叉級(jí)聯(lián)等[12]。研究[13]顯示，Notch1及Notch2能夠在體內(nèi)及體外參與小鼠胃黏膜上皮的干細(xì)胞及祖細(xì)胞的增殖、胃黏膜上皮細(xì)胞的分化。胃癌組織中Notch1、Notch2及Jagged1的高表達(dá)與腫瘤的遷移有關(guān)[14-15]。也有研究[16]發(fā)現(xiàn)，Notch1和Notch2在胃癌癌前病變組織及胃癌中均有更高的表達(dá)，其高表達(dá)量預(yù)示胃癌形成的高風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 N1IC、N2IC、COX-2蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá) A：灰度值；B：電泳條帶圖Fig 2 The protein expression of N1IC, N2IC, COX-2 in gastric cancer tissues and paracancerous tissues A: grey level;B: the diagram of electrophoretic strip

表2 N1IC、N2IC、COX-2與胃癌臨床病理學(xué)關(guān)系Tab 2 The relationship with N1IC, N2IC, COX-2 and gastric cancer clinical pathology

本研究使用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR法及Western blotting法檢測(cè)了胃癌組織中Notch1、Notch2及COX-2的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，胃癌中Notch1的轉(zhuǎn)錄與活化水平均顯現(xiàn)降低趨勢(shì)，提示在胃癌中Notch1可能是低表達(dá)的，可能為Notch1在不同類(lèi)型腫瘤及腫瘤不同階段存在差異表達(dá)的可能性提供佐證；COX-2作為致癌因子參與腫瘤包括胃癌的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)得到很多研究的證實(shí)[17-19]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)COX-2升高可能與腫瘤的分化及浸潤(rùn)深度有關(guān)。同時(shí)Notch2與COX-2同向高表達(dá)，提示Notch2可能通過(guò)調(diào)控COX-2的表達(dá)參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。非甾體類(lèi)消炎藥可以通過(guò)抑制COX-2/Notch的表達(dá)選擇性減少結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量。N2IC可能與COX-2啟動(dòng)子結(jié)合從而促進(jìn)胃癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。總的來(lái)說(shuō)，目前對(duì)于COX-2與Notch信號(hào)通路關(guān)系的相關(guān)研究相對(duì)仍較少，其調(diào)控關(guān)系相對(duì)復(fù)雜，有待更多的研究進(jìn)一步證實(shí)，并為胃癌的臨床治療與研究提供新的分子治療的靶點(diǎn)。

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