白細胞介素-6在潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠Th17/Treg細胞失衡中的作用

龐艷華，吳東方，馬亞會，解有福，郝建宇，劉 振，李 寧，劉心娟

1.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100020；2.北京市海淀區(qū)婦幼保健院內(nèi)科

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病機制尚不明確，目前認為，具有遺傳傾向的個體發(fā)生了不適當?shù)酿つっ庖叻磻瞧渲饕l(fā)病機制[1]。最近研究[2]發(fā)現(xiàn)，Th17和CD4+T細胞亞群形成一個新的免疫軸，與UC的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Th17是炎癥性腸病的重要細胞因子，能產(chǎn)生IL-17A等前炎癥因子，促進局部組織損傷。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是CD4+T細胞的一個亞群，屬于免疫抑制細胞，在UC的發(fā)病中起重要作用。Th17和Treg無論是在分化上還是功能上都是此消彼長的關系。研究[3]發(fā)現(xiàn)，UC中存在著Th17與Treg細胞的失衡，我們的研究[4]進一步證實，UC時Treg細胞分化及功能的異常突出表現(xiàn)在結(jié)腸固有層局部。IL-6在Th17細胞的分化中發(fā)揮著至關重要的作用，IL-6和TGFβ可共同誘導原始T細胞分化為Th17細胞[5]。因此，我們進一步關注IL-6在UC小鼠結(jié)腸固有層局部Treg/Th17失衡中的作用。本研究以DSS誘導的UC模型小鼠作為研究對象，檢測結(jié)腸固有層Treg細胞和Th17細胞及其相關細胞因子的水平，及IL-6在外周血及不同組織中的表達，探討IL-6在UC小鼠結(jié)腸固有層Th17/Treg失衡中的作用。

1 材料和方法

1.1動物模型的建立6～8周齡實驗動物選用SPF級雄性C57BL/6小鼠10只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量18～20 g，每日給予標準飼養(yǎng)、自由飲水及日常光照。將C57BL/6雄性小鼠完全隨機分成實驗組(UC組，5只)和對照組(NC組，5只)。UC組應用質(zhì)量濃度為25 g/L的DSS溶液作為飲用水7 d，繼之飲用蒸餾水7 d；對照組飲用蒸餾水14 d，造模為期14 d，14 d后脫頸處死小鼠。按照Murthy評分系統(tǒng)，評估UC組小鼠活動度指數(shù)(disease activity index, DAI)，結(jié)腸組織病理學表現(xiàn)證實并評估UC，證實造模成功。

1.2主要試劑葡聚糖硫酸鈉 (DSS) (MP Biomedical)，流式抗體及相關試劑CD4-PerCP (BD PharmingenTM)、CD25-APC(BD PharmingenTM)、CD45RA-PE(BD PharmingenTM)、IL-17-Alexa Fluor?488(BD PharmingenTM)、FoxP3-PE-Cyanine7(eBioscience)、CD3e-PE-CF594(BD HorizonTM)、CD8a-BV510(BD HorizonTM)，fixation and permeabilization (eBioscience)，Human Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 13plex Kit (BD PharmingenTM)。

1.3Treg及Th17細胞的檢測提取小鼠結(jié)腸固有層黏膜單個核細胞在24孔培養(yǎng)皿中加入2 μl白細胞混合刺激劑/106個細胞，放置體積分數(shù)為5%的CO2，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)5 h，室溫避光孵育CD4、CD25、CD45RA抗體15 min；按照操作手冊細胞破膜后避光孵育FoxP3、IL-17抗體20 min，應用Beckman流式細胞儀分析Treg細胞及Th17細胞水平。

1.4細胞因子的檢測按照操作說明，應用小鼠Th1/Th2/Th9/Th17/Th22細胞因子試劑盒，分別用熒光抗體標記外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜、脾臟單個核細胞培養(yǎng)上清液，利用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)檢測細胞因子的水平。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸固有層黏膜Treg細胞及其細胞因子的表達UC組結(jié)腸固有層黏膜Treg細胞水平高于NC組[(14.240±1.693)%vs(4.786±0.4709)%，P=0.0007]；但UC組結(jié)腸固有層黏膜單核細胞培養(yǎng)上清中IL-10的水平低于NC組[(2.758±0.5339)pg/mlvs(4.383±0.07667)pg/ml，P=0.049]。

2.2結(jié)腸固有層黏膜Th17細胞及其相關細胞因子的表達UC組結(jié)腸固有層黏膜中Th17細胞的水平高于NC組[(4.700±0.2477)%vs(2.806±0.2150)%，P=0.0004]；同時，UC組結(jié)腸固有層單核細胞培養(yǎng)液中IL-17A的水平也高于NC組[(3.032±0.3099)pg/mlvs(2.150±0.2161)pg/ml，P=0.047]。

2.3UC小鼠不同組織中IL-6的表達水平UC小鼠血清和結(jié)腸固有層單個核細胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平分別高于回腸、外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)(與血清比較：P=0.0071、0.0003，P=0.0003、0.0003；與結(jié)腸比較：P=0.0014、<0.0001，P<0.0001、<0.0001)；血清培養(yǎng)上清液中IL-6水平高于結(jié)腸(P=0.0145)；回腸單個核細胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平高于外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)(P=0.0435、0.0331、0.0223)，外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)單個核細胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 兩組小鼠不同組織單個核細胞上清培養(yǎng)液中IL-6水平的比較Tab 1 The expression of IL-6 in different tissues of each group pg/ml

注：與NC組比較，aP<0．05。

3 討論

UC是免疫介導的腸道炎癥性疾病，存在多種發(fā)病機制[6]，免疫學因素與UC的發(fā)生最為密切，而CD4+T細胞亞群在免疫調(diào)節(jié)方面尤為重要[7]。祝斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)，UC模型小鼠中結(jié)腸黏膜和外周血Treg細胞升高。公認地，無論是Treg細胞還是Th17細胞的分化，TGFβ都是必需的細胞因子。Na?ve T細胞在TGFβ和IL-2的作用下可以分化為Treg細胞[9-10]，在TGFβ和IL-6的作用下可以分化為Th17細胞[11]。我們前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，UC模型小鼠結(jié)腸固有層單核細胞中Treg水平高于其他組織，但FoxP3 mRNA表達下降，IL-10水平降低，提示UC發(fā)病時雖然結(jié)腸局部Treg細胞的比例升高，但其免疫抑制功能存在缺陷。Th17細胞屬于炎癥反應性細胞，特征性分泌IL-17A、IL-17F等促炎癥細胞因子對抗外來病原菌或異物[12]，此外，Th17細胞在IL-23促炎癥因子的協(xié)同下可以引起腸道黏膜和腸道益生菌群的破壞[13]。研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，在UC腸道黏膜中，Th17細胞數(shù)量明顯升高，且Th17細胞浸潤水平與腸道炎癥反應呈正相關。也有文獻[16]報道，UC外周血Th17細胞數(shù)量增多。由此可見，Th17細胞參與UC的發(fā)病。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，UC模型小鼠結(jié)腸固有層黏膜中Treg細胞及Th17細胞比例同時升高，同時伴有Treg細胞功能受限，提示UC模型鼠結(jié)腸中，不僅存在免疫抑制功能的不足，同時存在過度的炎癥反應，在UC中存在Th17和Treg細胞的免疫失衡。這與YANG等[17]研究一致。

UC主要累及腸道，而其他風濕免疫性疾病，如狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等，往往累及多個系統(tǒng)共同發(fā)病[18]。我們通過UC模型小鼠實驗的研究，同時觀察外周淋巴器官和中樞淋巴器官，發(fā)現(xiàn)IL-6在UC組結(jié)腸固有層黏膜的表達高于NC組，而在外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜及脾臟表達與NC組差異無統(tǒng)計學意義。說明IL-6參與了UC的發(fā)病，且在結(jié)腸黏膜局部發(fā)揮免疫作用。這種免疫紊亂在腸黏膜最顯著，也與UC多累及局部腸管，很少累及其他系統(tǒng)的臨床特點相一致。

IL-6是一個在許多免疫系統(tǒng)反應中起重要作用的多效性細胞因子，包括活化B細胞的生長和最終分化、刺激T細胞增殖及細胞毒性T細胞的分化。炎癥性腸病患者IL-6主要來源于活化的單核和巨噬細胞，IL-6是UC中參與調(diào)節(jié)炎癥強有力的細胞因子[19-20]。IL-6在Th17的應答和抑制Treg功能兩方面都起關鍵作用。Treg能分泌IL-10、IL-35、TGFβ等細胞因子，通過細胞與細胞接觸的方式影響效應T細胞的增殖及炎性細胞因子的釋放，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，維持對自身抗原的免疫耐受和防止自身免疫性疾病的發(fā)生[21]。Treg細胞的異常參與了多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)病，如1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎及炎癥性腸病等。UC患者腸上皮屏障破壞、持續(xù)性的腸腔抗原刺激使巨噬細胞和樹突狀細胞分泌大量促炎癥因子IL-6和IL-12等，促進Th1和Th17細胞系的分化，抑制Treg的功能。Treg細胞功能缺陷與UC發(fā)病有關，提示UC炎性反應亢進，而免疫抑制不足[22]。TGFβ可誘導初始T細胞產(chǎn)生Treg，Treg活化在IL-6存在時可導致TGFβ產(chǎn)生。之后，IL-6和TGFβ誘導Treg向Th17亞群分化，產(chǎn)生IL-17。而當IL-6過度表達時，在這個復雜的網(wǎng)絡關系作用下Treg細胞與Th17細胞間出現(xiàn)分化及功能的失衡。此外，已有研究[23]顯示，阻止IL-6可能控制Th17介導的免疫反應。

UC為炎癥性腸病的一種常見類型，主要病理表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜炎癥。國內(nèi)學者在多發(fā)性硬化鼠模型中發(fā)現(xiàn)IL-6升高[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，除了結(jié)腸固有層局部IL-6水平升高外，UC小鼠血清中IL-6水平也高于對照組。國外POWELL等[25]研究認為，在UC患者癥狀出現(xiàn)前可有IL-6等血清學異常。IL-6信號系統(tǒng)在腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)和IBD發(fā)病機制中起作用，但在IBD癥狀前監(jiān)測IL-6是否足夠特異還無定論。本研究發(fā)現(xiàn)，UC模型小鼠存在IL-6升高，特別是在結(jié)腸固有層黏膜，這種UC結(jié)腸黏膜IL-6的表達異常可能是引起UC患者結(jié)腸黏膜病變的免疫基礎，其機制還需進一步研究。

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