以DNA四面體為載體研究CpG對免疫Melan-A抗原肽協(xié)同作用

和晨辰 ，尹澤清 ，孫麗范 ，于 露 ，洪恩律 ，石文琦 ，李海東 ，沈萬秋

（天津醫(yī)科大學1.藥學院；2.基礎醫(yī)學院；3.公共衛(wèi)生學院，天津300070）

黑色素瘤是皮膚腫瘤中惡性程度最高的瘤種，容易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，早期診斷和治療尤為重要[1]。體外研究發(fā)現(xiàn)，T細胞可以特異性識別黑色素瘤Melan-A抗原肽,進而起到預防黑色素瘤細胞形成和抑制黑色素瘤細胞生長的作用[2]。CpG ODNS作為一種具有免疫刺激作用的治療型核酸，可以觸發(fā)細胞核內(nèi)的TLR9受體，引起樹突細胞成熟，提高免疫原性，被廣泛用于傳染性疾病。CpG ODNS其對于Melan-A抗原肽的預防及治療黑色素瘤的效果具有一定的增強作用[2-3]。Romero教授實驗室[4]將CpG與Melan-A抗原肽和佐劑混合，作為疫苗注射到HLA-A2＋黑色素瘤患者體內(nèi),發(fā)現(xiàn)其分泌了1~3倍免疫性細胞因子。但是CpG和Melan-A抗原肽之間的距離，及CpG數(shù)量對Melan-A抗原肽作用的影響還有待進一步研究。DNA納米結(jié)構(gòu)可定點修飾，控制修飾的點之間距離、位置及數(shù)量的特性及其先天的生物相容性、自組裝性使其可用作良好的藥物傳遞納米載體[5-8]。其中，DNA四面體結(jié)構(gòu)擁有合成簡單，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定優(yōu)點，近來被優(yōu)先作為藥物納米載體進行研究。Walsh等[9]證明DNA四面體可以進入細胞并且可以保證結(jié)構(gòu)完整的在細胞中存在48 h；Li等[10]將有免疫刺激的CpG寡義核苷酸形成DNA四面體在細胞內(nèi)進行培養(yǎng)，誘導免疫刺激，產(chǎn)生高水平的免疫因子包括腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6、IL-12。Lee等[11]將能抑制或沉默癌細胞基因的siRNA和葉酸配體與四面體連接注射到移植瘤小鼠模型上，發(fā)現(xiàn)連有葉酸和siRNA的四面體可以靶向性地沉默腫瘤基因。Kim等[12]將阿霉素裝載到四面體上，克服了乳腺癌細胞的耐藥性。Xia等[13]將可穿透腫瘤細胞的肽鏈連接到四面體上，靶向地進入到癌細胞。這些研究進一步證明了DNA四面體結(jié)構(gòu)是一個良好的藥物傳遞納米載體。在本論文中，筆者將CpG與Melan-A抗原肽連接在四面體上，將CpG與肽鏈固定位置并將距離拉近，研究CpG對具有免疫原性的Melan-A抗原肽預防黑色素瘤的協(xié)同作用。同時，筆者研究了增加連接的CpG個數(shù)對協(xié)同作用的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 6周齡雌性C57小鼠（中國醫(yī)學科學院研究所實驗動物中心）；Melan-A抗原肽（吉爾生化上海有限公司）；Mouse IL-6 ELISA kit（北京達科為生物技術有限公司）；DNA和CpG單鏈（美國 Integrated DNA Technologies）；G-25microspin columns（GE Life Sciences），Spin-concentrators（Merck）；多功能酶標儀（美國Molecular Devices），高效液相色譜儀（美國 Agilent 1100）。

1.2 DNA和 CpG序列 TA（5′-ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A-3′）TB（5′-TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C-3′）TC （5′-TCA ACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C-3′）TD（5′-TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3′）1826TA（5′-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TTT TTT T ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A-3′）1826TD（5′-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TTT TTT T TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3′）

1.3 DNA鏈TC連接Melan-A抗原肽 氨基修飾DNA鏈與DBCO-sulfo-NHS（100 mmol/L pH 8.5磷酸鹽緩沖液）于常溫條件下，震蕩2 h，再加入DBCO-sulfo-NHS（100 mmol/L pH 9.5磷酸鹽緩沖液）于常溫條件下，震蕩2 h，生成DNA-DBCO。使用G-25 microspin columns將多余的DBCO-sulfo-NHS除去并濃縮體積。將DNA-DBCO與疊氮修飾的肽鏈在含有140 mmol/L NaCl的PBS溶液中進行反應，過夜。使用Spin-concentrators除去多余的肽鏈并濃縮體積，然后通過以TEAA與乙腈：水=90：10兩種溶液作為流動相的高效液相進行提純。

1.4 四面體納米結(jié)構(gòu)的準備 將4條DNA鏈等摩爾比值加入緩沖液中（50 mmol/L TAE，pH=8.0，50 mmol/L MgCl2）。溶液被加熱到95℃5 min，然后迅速降到4℃。

1.5 建立小鼠模型 將C57小鼠分為3組，每組6只，同時分別腹腔注射等摩爾的四面體-Melan-A肽、四面體-Melan-A肽-CpG(I)、四面體-Melan-A肽-CpG（II），在不同時間眼內(nèi)眥取血。將血液4℃靜置1 h，2 000 r/min離心30 min，取上層血清。使用試劑盒和酶標儀對血清中的細胞因子濃度進行測定。

2 結(jié)果

2.1 DNA鏈TC與Melan-A結(jié)合 通過高效液相色譜圖和質(zhì)譜圖，可以證明Melan-A抗原肽已經(jīng)連接到DNA鏈上（圖1，圖2）。高效液相色譜圖中9.853處峰為未修飾的DNA，16.052處峰為DBCODNA，17.031處峰為DNA-Melan-A肽。質(zhì)譜圖中18 540.129峰為DNA-Melan-A抗原肽的相對分子質(zhì)量。

圖1 DNA-肽高效液相色譜圖Fig 1 HPLC spectrum for DNA-Melan-A peptide

2.2 構(gòu)建DNA四面體結(jié)構(gòu) 由55個堿基的DNA鏈、DNA-肽、1826TA、1826TD通過自組裝形成正四面體結(jié)構(gòu)。將DNA-Melan-A抗原肽、DNA-CpG鏈與其他未修飾DNA鏈結(jié)合形成四面體-Melan-A肽、四面體-Melan-A肽-CpG(I)和四面體-Melan-A肽-CpG(II)（圖3）。

圖3 四面體-Melan-A 肽（A）、四面體-Melan-A 肽-CpG(I)（B）、四面體-Melan-A肽-CpG(II)（C）結(jié)構(gòu)示意圖Fig 3 Synthetic scheme for the Tetrahedron-Melan-A peptide,Tetrahedron-Melan-A peptide-CpG (I),Tetrahedron-Melan-A peptide-CpG(II)

2.3 DNA四面體的結(jié)構(gòu)表征 聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果證明3種結(jié)構(gòu)可以形成（圖4）。

圖4 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig 4 Polyacrylamide gel

2.4 C57小鼠細胞因子變化 對小鼠血清中的細胞因子進行測定，3組的IL-6逐組增加。結(jié)果顯示將Melan-A抗原肽和CpG固定在DNA四面體上，產(chǎn)生的細胞因子分別為9.238 pg/mL、17.150 pg/mL、18.865 pg/mL（圖 5）。

圖5 小鼠血清IL-6濃度圖Fig 5 Mouse serum IL-6 concentration

3 討論

本實驗成功設計了特定結(jié)構(gòu)的DNA四面體，人工修飾Melan-A抗原肽和CpG。證明修飾的四面體結(jié)構(gòu)可穩(wěn)定存在，通過注射到小鼠體內(nèi)，測量到四面體-肽-CpG（I）的IL-6細胞因子濃度比四面體-Melan-A肽增高了7.912 pg/mL，四面體-Melan-A肽-CpG（II）增高了9.627 pg/mL。實驗證明DNA四面體納米結(jié)構(gòu)能夠定點修飾CpG和Melan-A抗原肽，并可控地修飾CpG數(shù)量，增強了CpG和Melan-A抗原肽的協(xié)同作用，是藥物傳遞的優(yōu)良納米載體，可用于預防和治療黑色素瘤。

在未來的研究中，筆者將探究四面體-肽-CpG能否抑制小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長以及能否殺死黑色素瘤細胞，為今后黑色素瘤的治療提供新的可能。

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