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    白酒黃水中提取乳酸鏈球菌素的研究

    2018-05-30 06:40:21孫中理常少健唐賢華
    釀酒科技 2018年5期
    關(guān)鍵詞:效價(jià)鏈球菌乳酸

    李 覓 ,張 磊 ,孫中理 ,郭 杰 ,余 航 ,常少健 ,唐賢華 ,王 晗

    (1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,四川成都611130; 2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都611130; 3.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川瀘州646000; 4.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川成都611830; 5.四川理工學(xué)院,四川自貢643000)

    乳酸鏈球菌素(Nisin)可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌,對(duì)芽孢桿菌的孢子有強(qiáng)烈抑制作用[1]。因此,作為食品防腐劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè),對(duì)食品的色、香、味、口感等無不良影響,且食用后不會(huì)改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群,更不會(huì)與其他抗菌素出現(xiàn)交叉抗性,是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑[2]。

    以黃水為主的固態(tài)釀造廢水中存在大量的乳酸菌[3],乳酸菌在發(fā)酵代謝過程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸外,還產(chǎn)生大量的有抑菌或殺菌作用的乳酸鏈球菌素[4]。利用大孔吸附樹脂對(duì)黃水中的乳酸鏈球菌素進(jìn)行粗提取,研究樹脂添加量、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速、提取溫度等因素對(duì)提取效果的影響,以確定乳酸鏈球菌素的最適合提取條件[5],為釀酒廢水的資源化利用提供思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑及儀器

    菌株:藤黃微球菌(釀酒生物與技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)。

    試劑及耗材:大孔吸附樹脂(NAK-Ⅱ,天津南開大學(xué)樹脂有限公司),乳酸鏈球菌素Nisin標(biāo)準(zhǔn)品(106 IU/g,Sigma),乙腈(色譜純,Sigma),三氟乙酸、葡萄糖、乙醇、NaCl、HCl、Na2HPO4·12H2O(AR,成都科龍化工試劑廠),瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏(BR,北京奧博星)。

    儀器設(shè)備:電子天平,常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;分析天平,梅特勒托利多;高效液相色譜(1260),美國(guó)Agilent;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;振蕩培養(yǎng)器,上海博訊;高溫滅菌鍋,上海申安。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 提取工藝[6-8]

    預(yù)處理:將黃水粗濾,除去酒糟、稻殼等雜質(zhì),5000 r/min離心,除去沉淀。

    提?。侯A(yù)處理后的黃水加入大孔吸附樹脂(樹脂使用前按照說明書預(yù)處理),置于搖床提取一定時(shí)間,收集樹脂,加入80%、pH2的乙醇解吸后,收集清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去溶劑,加入0.02 mol/L的鹽酸溶液溶解,得到粗提液。

    1.2.2 效價(jià)測(cè)定[9-10]

    (1)指示菌:藤黃微球菌

    (2)營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨1%,牛肉膏0.3%,NaCl 0.5%,瓊脂1.5%,pH7.0。

    (3)效價(jià)檢測(cè)培養(yǎng)基(g/100 mL):蛋白胨0.8,葡萄糖0.5,酵母浸膏0.25,氯化鈉0.5,瓊脂粉1,1%Na2HPO4·12H2O,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

    (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    準(zhǔn)確稱取100 mg Nisin標(biāo)準(zhǔn)品,溶于10 mL無菌0.02 mol/L的鹽酸稀溶液中,配成104 IU/mL的Nisin儲(chǔ)備液。取Nisin儲(chǔ)備液,以0.02 mol/L無菌鹽酸為稀釋液,制備濃度為1000 IU/mL、500 IU/mL、250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、10 IU/mL的Nisin工作液。

    將檢測(cè)培養(yǎng)基熔化并冷卻至50℃左右,用移液管移取15 mL到無菌平皿中,使其在培養(yǎng)基均勻涂布,放置在水平臺(tái)上凝固后,作為底層平板;另取檢測(cè)培養(yǎng)基適量,熔化后冷卻至45℃左右,加入制好的菌懸液使最終濃度在107~108cfu/mL,迅速搖勻,用移液管移取5 mL在底層上均勻涂布,作為菌層。置水平臺(tái)上冷卻后將牛津杯均勻直立于培養(yǎng)基上。加入200 μL不同濃度工作液于每個(gè)牛津杯中,30℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定抑菌圈直徑。

    (5)提取樣品效價(jià)測(cè)定

    取200 μL粗提液按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定。

    1.2.3 單因素試驗(yàn)

    設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn),以提取物效價(jià)評(píng)估提取效果,分別研究樹脂添加量、提取溫度、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速等條件對(duì)提取效果的影響。

    樹脂添加量選擇:在30℃條件下,向黃水中分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%樹脂,于搖床100 r/min,提取6 h。研究樹脂添加量對(duì)提取效果的影響。

    提取溫度選擇:向黃水中添加1.5%樹脂,分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下,于搖床100 r/min,提取6 h。研究溫度對(duì)提取效果的影響。

    提取時(shí)間選擇:在30℃條件下,向黃水中添加1.5%樹脂,搖床100 r/min分別提取6 h、12 h、18 h、24 h、30 h。研究提取時(shí)間的影響。

    轉(zhuǎn)速選擇:在30℃條件下,向黃水中添加1.5%樹脂,搖床分別以 50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min的轉(zhuǎn)速提取6 h。研究轉(zhuǎn)速對(duì)提取效果的影響。

    1.2.4 正交優(yōu)化

    以提取物效價(jià)評(píng)估提取效果,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 正交試驗(yàn)因素與水平

    1.2.5 高效液相色譜條件定性[11]

    粗提液用0.22 μm膜過濾后,用高效液相色譜定性。

    色譜柱:C18柱,檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器,波長(zhǎng):220 nm,流速:1.5 mL/min,柱溫:25 ℃,進(jìn)樣量50 μL,流動(dòng)相:A(90%乙腈+0.1%三氟乙酸)、B(10%乙腈+0.1%三氟乙酸)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo),乳酸鏈球菌素效價(jià)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。R2=0.9965,線性較好,滿足試驗(yàn)需求。

    圖1 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 樹脂添加量影響(見圖2)

    圖2 樹脂添加量對(duì)提取效果的影響

    由圖2可知,隨著樹脂添加量的增加,提取物的效價(jià)逐漸提升,說明樹脂量越大,吸附的乳酸鏈球菌素越多。樹脂添加量從0.5%到1.5%,乳酸鏈球菌素吸附量增加幅度較大,樹脂添加量從1.5%到2.5%,乳酸鏈球菌素吸附量增加幅度較小??赡苁且?yàn)辄S水中一定量的乳酸鏈球菌素被樹脂吸附,含量明顯降低,低到一定程度,樹脂無法吸附。

    2.2.2 提取時(shí)間影響(見圖3)

    圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

    如圖3可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸鏈球菌素的提取量逐漸增加,18~24 h范圍內(nèi)增加幅度較大,之后趨于平緩,說明樹脂對(duì)乳酸鏈球菌素的吸附達(dá)到飽和。

    2.2.3 轉(zhuǎn)速影響(見圖4)

    圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)提取效果的影響

    如圖4所示,在50~150 r/min范圍內(nèi),增加轉(zhuǎn)速,可以使乳酸鏈球菌素的提取量增加,但繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速,會(huì)引起乳酸鏈球菌素提取量一定程度的降低,最終趨于平緩。一定范圍內(nèi)增加轉(zhuǎn)速可以使乳酸鏈球菌素分子與吸附劑樹脂充分接觸,有利于吸附。但轉(zhuǎn)速過高,可能會(huì)因機(jī)械力的作用而對(duì)吸附造成不利影響。

    2.2.4 溫度影響(見圖5)

    圖5 溫度對(duì)提取效果的影響

    由圖5可知,在20~40℃范圍內(nèi),隨著溫度升高,乳酸鏈球菌素吸附量增多,在40~60℃范圍,隨著溫度升高,乳酸鏈球菌素吸附量減少。溫度升高,分子運(yùn)動(dòng)加劇,增加乳酸鏈球菌素分子與吸附劑樹脂的碰撞機(jī)會(huì),一定溫度范圍內(nèi)升高溫度,吸附量增加;但吸附本身是放熱過程,溫度升高,樹脂的吸附能力降低。

    2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化乳酸鏈球菌素的粗提取條件,正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。通過對(duì)比極差R可以看出,影響乳酸鏈球菌素提取效果的因素:樹脂添加量>提取溫度>提取時(shí)間>轉(zhuǎn)速。通過比較均值k可以看出,乳酸鏈球菌素最優(yōu)提取條件組合為A2B2C3D3,通過驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取條件為A2B2C3D3時(shí),效價(jià)為572.02 IU/mL,因此乳酸鏈球菌素最合適提取條件為:樹脂添加量1.5%,提取溫度50℃,提取時(shí)間24 h,轉(zhuǎn)速150 r/min。

    表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.4 高效液相色譜分析定性結(jié)果(圖6、圖7)

    圖6 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析

    圖7 粗提取樣品的色譜分析

    采用高效液相色譜對(duì)粗提取物進(jìn)行定性,乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間在9.413 min,粗提取物在9.420 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)特征峰,從保留時(shí)間的一致性可以初步判定粗提取物為乳酸鏈球菌素,但粗提取物仍存在較多雜質(zhì),需進(jìn)一步純化。

    3 結(jié)論

    通過正交試驗(yàn)探究了大孔吸附樹脂添加量、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速、提取溫度對(duì)黃水中乳酸鏈球菌素粗提取的影響,結(jié)果表明影響因素的順序?yàn)闃渲砑恿浚咎崛囟龋咎崛r(shí)間>轉(zhuǎn)速。乳酸鏈球菌素最合適提取條件為:樹脂添加量1.5%,提取溫度50℃,提取時(shí)間24 h,轉(zhuǎn)速150 r/min,粗提取物效價(jià)為572.02 IU/mL。

    [1]房春紅,劉杰,許修宏.乳酸菌素的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)乳品工業(yè),2006,34(2):53-55.

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