甲基化狀態(tài)風(fēng)險(xiǎn)分析對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后評(píng)價(jià)意義

康恩銘 章薇 章翔

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其患者的中位生存期僅有14個(gè)月左右[1]。DNA序列中胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(cytosine-phosphate-guanine, CpG)雙核苷酸的甲基化，可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性、改變基因穩(wěn)定性、重塑基因結(jié)構(gòu)從而對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生明顯的影響。目前對(duì)DNA甲基化研究最多的是啟動(dòng)子內(nèi)CpG島(CpG island, CGI)甲基化。然而，只有大約70%的基因包含啟動(dòng)子CGI，并且只有6.8%的CpG雙核苷酸位點(diǎn)在CGI中。GCI shores位于傳統(tǒng)CGI兩側(cè)2 kb范圍內(nèi)區(qū)域，其CpG密度較GCI相對(duì)較低。有研究證實(shí)，組織和腫瘤特異性的DNA差異甲基化在CGI shores區(qū)域發(fā)生更頻繁，而DNA甲基化也可以直接通過(guò)影響非CGI啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)改變腫瘤細(xì)胞的甲基化模式[2]。目前，CGI shores甲基化狀態(tài)與GBM患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確。在本研究中，我們利用在線GBM數(shù)據(jù)庫(kù)，建立并驗(yàn)證了與GBM患者臨床預(yù)后密切相關(guān)的基于7個(gè)基因(AP3B1, RGS16, PPM1M, ENPP4, GOLGB1, CACNA2D2, TMEM16)的啟動(dòng)子所在GCI shores甲基化狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程，為進(jìn)一步明確GBM甲基化改變模式以及探索GBM發(fā)病機(jī)制提供了有力依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、GBM病例全基因組甲基化數(shù)據(jù)庫(kù)

GBM病例全基因組甲基化芯片數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)均通過(guò)以下在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲得：癌癥和腫瘤基因圖譜計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas, TCGA)，數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址：https://cancergenome.nih.gov/?；虮磉_(dá)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Experssion Omnibus, GEO)中的GSE36278系列和GSE60274系列，數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。

本研究選取成人GBM病例的Illumina Human甲基化450 k芯片測(cè)量數(shù)據(jù)，排除生存資料不全以及OS<7 d的非死亡病例，最后納入TCGA病例組：136例，GSE36278病例組：37例，GSE60274病例組：62例。

二、甲基化芯片數(shù)據(jù)的處理

我們將各數(shù)據(jù)庫(kù)提供的所有235例甲基化表達(dá)芯片(Illumina Human 450 k)樣本的beta值數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為M值。隨后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)探針進(jìn)行篩選：去除包含SNP位點(diǎn)的探針和去除沒(méi)有UCSC位點(diǎn)信息的探針。在篩選后的探針中，我們選取了啟動(dòng)子相關(guān)的CGI shores探針進(jìn)行研究(n=16 792)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用生物計(jì)量研究分支測(cè)量(Biometric Research Branch-Array, BRB)軟件以及SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。甲基化探針的M值和病例組生存之間關(guān)系采用置換檢驗(yàn)(permutation test)和單因Cox回歸模型分析法。置換檢驗(yàn)根據(jù)10 000次隨機(jī)置換計(jì)算，并選取P<0.001做為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。篩選后的位點(diǎn)應(yīng)用多元Cox回歸模型分析，以此建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程。我們使用實(shí)驗(yàn)組的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分值M將各病例組患者分成高風(fēng)險(xiǎn)阻和低風(fēng)險(xiǎn)組，隨后采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組、低風(fēng)險(xiǎn)組分別進(jìn)行生存期分析。

結(jié) 果

一、GBM病例的一般資料

本研究共納入235例來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(136例)，GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(99例，其中GSE60274系列 62例及GSE36278系列37例)的成人GBM病例，其中男144例，女91例；235例患者的平均年齡為(55.2±13.1)歲。各數(shù)據(jù)庫(kù)病例的人口學(xué)特征及臨床資料詳見表1。

表1 所選GBM數(shù)據(jù)庫(kù)的患者臨床資料特征

Tab 1 Patients' characteristics of included GBM datasets

GBMdatasetsAllpatientsTCGAGSE36278GSE60274 Samplesize2351363762 Gender(male/female)144/9178/5819/1847/15 Age(x±s)55.2±13.160.1±12.844.2±10.051.0±9.5 TMZtherapy12593-32 Methylated/unmethylated54/7138/55-16/16

GBM: glioblastoma; TMZ: temozolomide.

二、生存相關(guān)CGI shores探針篩選

由于GSE36278病例組樣本量較小，我們將TCGA病例組(n=136)和GSE36278病例組(n=37)合并為實(shí)驗(yàn)組(n=173)。通過(guò)使用BRB軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)組的GCI shores位點(diǎn)甲基化M值進(jìn)行單因Cox回歸模型分析和置換檢驗(yàn)。根據(jù)P<0.001標(biāo)準(zhǔn)，在16 792個(gè)CGI shores探針中得到112個(gè)與生存密切相關(guān)的探針。隨后在實(shí)驗(yàn)組中對(duì)這112個(gè)探針的甲基化M值進(jìn)行多元Cox回歸模型分析，根據(jù)P<0.01標(biāo)準(zhǔn)，最后得到7個(gè)與生期相關(guān)的探針位點(diǎn)(表2)。

表2 與實(shí)驗(yàn)組病例生存相關(guān)的GCI shores探針

Tab 2 GCI shores probes were significantly associated with the overall survival in the training-set patients

ProbeIDCoefficientHRGeneTypeReportedfunctiononcancercells Groupdifference0.0591.061 cg24814117-0.2750.759AP3B1S_Shoreunknown cg25591868-0.2820.754RGS16S_Shoreimproveproliferation cg084386900.3541.424PPM1MN_Shoreunknown cg03113285-0.1640.849ENPP4S_Shoreunknown cg25340675-0.6680.513GOLGB1S_Shoreunknown cg25821785-0.3630.695CACNA2D2S_Shoreimproveproliferation,angiogenesis cg10822582-0.3000.741TMEM16S_Shoreimproveproliferation,migration,invasion

HR: harzad ratio.

三、基于7-CGI shores甲基化探針M值風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程的建立

根據(jù)cox結(jié)果的回歸系數(shù)建立了基于這7個(gè)探針位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程：Risk score=(-0.275 M value of cg24814117)+(-0.282 M value of cg25591868)+(0.354 M value of cg08438690)+(-0.164 M value of cg03113285)+(-0.668 M value of cg25340675)+(-0.363 M value of cg25821785)+(-0.300 M value of cg10822582)。實(shí)驗(yàn)組病例根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)值(M=4.4)分為低風(fēng)險(xiǎn)組(n=86)和高風(fēng)險(xiǎn)組(n=87)。高風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間(中位OS：8.5個(gè)月，95% CI：5.7～11.3月)明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)組(中位OS：16.2個(gè)月；95% CI：12.6～19.7個(gè)月)，χ2=41.365，P<0.001。

圖1 Kaplan-Meier檢驗(yàn)7-GCI shores甲基化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與各病例組患者生存的關(guān)系

Fig 1 The relationship between 7-GCI shores methylation signature and the cumulative survival of patients of each group was detected by using Kaplan-Meier

A: Training-set (combined TCGA and GSE36278 group,n=173): high risk (n=87)vslow risk (n=86), χ2=41.365,P<0.001; B: TCGA group (n=136): high risk (n=72)vslow risk (n=64), χ2=35.685,P<0.001; C: GSE36278 group (n=37): high risk (n=15)vslow risk (n=22), χ2=5.193,P=0.023; D: Testing set (GSE60274,n=62): high risk (n=25)vslow risk (n=37), χ2=8.665,P=0.003.

The high-risk and low-risk group of patients are determined on the basis of the median risk score from the training set patients.

四、7-GCI shores風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與TCGA病例組、GSE36278組和驗(yàn)證組預(yù)后的關(guān)系

為減少假陽(yáng)性結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程對(duì)GBM患者預(yù)后的預(yù)測(cè)作用，我們分別使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程計(jì)算了各病例的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分并用實(shí)驗(yàn)組中位風(fēng)險(xiǎn)值將TCGA病例組、GS36278病例組和實(shí)驗(yàn)組GSE60274分成了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。與實(shí)驗(yàn)組結(jié)果相似，TCGA病例組中高風(fēng)險(xiǎn)組(n=72)中位OS(8.1個(gè)月，95% CI：5.8～10.5個(gè)月)短于低風(fēng)險(xiǎn)組(n=64)中位OS(20.1個(gè)月，95% CI：17.4～22.8個(gè)月)，χ2=35.685,P<0.001；GSE36278病例組中高風(fēng)險(xiǎn)組(n=15)的中位OS(12個(gè)月，95% CI：11.5～12.5個(gè)月)短于低風(fēng)險(xiǎn)組(n=22)的中位OS(15個(gè)月，95% CI：12.4～17.6個(gè)月)，χ2=5.193,P=0.023；驗(yàn)證組GSE60274病例組中高風(fēng)險(xiǎn)組(n=25)的中位OS(10.5個(gè)月，95% CI：7.8～13.1個(gè)月)短于低風(fēng)險(xiǎn)組(n=37)的中位OS(16.0個(gè)月，95% CI：14.3～17.7個(gè)月)，χ2=8.665，P=0.003。

五、7-GCI shores風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者年齡，MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在預(yù)后評(píng)價(jià)中的關(guān)系

我們對(duì)所有使用替莫唑胺(temozolomide, TMZ)治療的病例(n=125)的年齡、MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)同7-GCI shores風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分一起進(jìn)行多因素Cox回歸模型分析。結(jié)果表明7-GCI shores風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是獨(dú)立于年齡和MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的預(yù)后因素(表3)。而在對(duì)所有病例進(jìn)行Cox回歸模型分析的結(jié)果也顯示7-GCI shores風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是獨(dú)立于年齡的預(yù)后因素(P<0.001, HR: 1.93, 95% CI: 1.59～2.33)。

表3 多因素Cox回歸分析7-GCI shores風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與年齡、MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)生存的影響

Tab 3 Effect of 7-GCI shores signature, age and MGMT promoter methylation status on survival by multivariate Cox analysis

PrognosticfactorHR95%CIPvalue Patientsgroup1.6420.94～2.880.083 Age1.0351.01～1.060.006 Gender1.2670.76～2.160.363 MGMTpromotermethylationsta-tus0.4570.24～0.880.018 7-GCIshoressignature2.0541.52～2.77<0.001

HR: hazard ratio; CI: confidence interval.

討 論

全基因組甲基化水平的高通量檢測(cè)平臺(tái)已經(jīng)為建立大樣本病例甲基化組奠定了較好的基礎(chǔ)。使用模式分析TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤CGI甲基化表型(G-CIMP)，隨后，G-CIMP陽(yáng)性和陰性表型所具有的分子基礎(chǔ)和染色體改變特點(diǎn)也被偶聯(lián)確認(rèn)[3]。然而，G-CIMP并不能完全解釋膠質(zhì)瘤的所有類型，其應(yīng)用具有一定的局限性。因此，研究非CGI甲基化改變模式對(duì)腫瘤的影響顯得甚為重要。CGI shores是CpG密度僅次于CGI的區(qū)域，然而其甲基化改變與GBM之間的關(guān)系目前尚無(wú)研究報(bào)道。

本研究選取了包含啟動(dòng)子的GCI shores進(jìn)行分析，最終得到了7個(gè)與GBM患者生存密切相關(guān)GCI shores。這7個(gè)GCI shores關(guān)聯(lián)的基因分別為銜接蛋白-3的β3A亞基(β1 subunit of adaptor protein-3, AP3B1)基因、G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白16(regulator of G protein signaling 16, RGS16)基因、Mg2+/Mn2+依賴的蛋白磷酸酶1M(protein phosphatase, Mg2+/Mn2+dependent 1M, PPM1M)基因、核苷酸內(nèi)焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 4, ENPP4)基因、高爾基體蛋白B1(golgin B1, GOLGB1)基因、鈣離子電壓門控通道輔助蛋白亞基α2δ2(calcium voltage-gated channel auxiliary subunit α2δ2, CACNA2D2)基因、穿膜蛋白16(transmembrane protein 16, TMEM16)基因。其中，TMEM16基因編碼穿膜蛋白16(transmembrane protein16)，也被稱為Anoctamin，是一種鈣激活氯通道(calcium-activatedchloridechannels, CaCCs)蛋白，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加可以激活其家族的Ano1(anoctamin1)從而調(diào)節(jié)唾液腺、氣管、胰腺、腸道、乳腺上皮細(xì)胞的分泌及細(xì)胞體積[4]。Ano1在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)增加，將其敲除可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[5]。RGS16基因編碼GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein, GAP)，是GTP酶激活α亞族的G蛋白偶聯(lián)受體。在正常或腫瘤細(xì)胞中GAP負(fù)向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)，Rho家族蛋白A和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/趨化因子受體4 (stromal cell derived factor 1/chemokine receptor type 4, SDF-1/CXCR4)等癌基因通路，這些通路在多種惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。乳腺癌患者中約有半數(shù)都會(huì)出現(xiàn)RGS16序列的不穩(wěn)定，敲除RGS16基因可增加乳腺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[6]。另外，RGS16基因表達(dá)上調(diào)可能受到p53和pRb基因的調(diào)節(jié)從而增加胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，降低患者的生存期[7]。CACNA2D2基因編碼α2δ2蛋白，該基因位于腫瘤抑制基因簇的染色體3p21.3區(qū)域，該區(qū)域超甲基化或缺失在肺癌和胰腺癌中均有發(fā)生[8]。但是CACNA2D2基因?qū)δ[瘤的作用存在爭(zhēng)議，Carboni等研究發(fā)現(xiàn)CACNA2D2基因高表達(dá)可促進(jìn)裸鼠的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)[9]。而在對(duì)前列腺癌的研究中，CACNA2D2基因卻表現(xiàn)出促癌作用，其表達(dá)增加可以激活前列腺癌細(xì)胞增殖，并增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)分泌[10]。AP3B1基因編碼銜接蛋白3 (adaptor related protein complex 3, AP-3)復(fù)合體的β3A亞基。AP-3復(fù)合體是異四聚體的復(fù)合體，系細(xì)胞質(zhì)中無(wú)所不在的蛋白，為生黑色素細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌溶酶體所必須成分，神經(jīng)元缺乏AP-3復(fù)合體會(huì)導(dǎo)致突觸小泡分泌異常[11]。在乳腺癌和肝癌中，AP3B1基因表達(dá)受到抑癌miRNA mir-9的直接調(diào)控，不過(guò)其對(duì)癌細(xì)胞的影響并不清楚[12]。ENPP4基因編碼核苷酸內(nèi)焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 4, ENPP4)，屬于ENPP家族。ENPP家族可以啟動(dòng)核苷二磷酸和核苷三磷酸的水解作用進(jìn)而影響骨和軟骨軟化、核苷酸循環(huán)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及各種嘌呤和嘌呤受體相關(guān)通路[13]。其在小鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型中表達(dá)異常[14]。GOLGB1基因位于染色體3q13，編碼高爾基體b1蛋白，是最大的高爾基復(fù)合體相關(guān)蛋白[15]。高爾基體蛋白在蛋白質(zhì)糖基化和胚胎發(fā)育中起作用，于骨髓增殖性腫瘤患者中GOLGB1基因可以和血小板轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體B形成融合基因[16]。以上基因中，部分已經(jīng)證實(shí)對(duì)某些腫瘤具有影響，但在它們GBM中的研究較少，仍需進(jìn)一步的離體和在體研究來(lái)深入我們對(duì)其功能的理解。

在本研究中，我們建立并驗(yàn)證了可以預(yù)測(cè)GBM患者生存的基于7個(gè)GCI shores區(qū)甲基化狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程。同樣，本風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是獨(dú)立于年齡和MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的GBM患者預(yù)后因素。使用該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程可更為準(zhǔn)確的評(píng)估GBM患者的預(yù)后，并指導(dǎo)GBM患者個(gè)體化治療。本研究是第一個(gè)探索GCI shores甲基化狀態(tài)與GBM預(yù)后關(guān)系的報(bào)道，加深GCI shores甲基化模式的理解將有助于完善G-CIMP以外的GBM表型，為今后進(jìn)一步完善GBM甲基化圖譜表明了新的方向。

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