SO2保鮮劑對(duì)玫瑰香葡萄灰霉菌的抑制作用

田 靜,薛美昭,儀慧蘭

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

葡萄是一種主要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物,全球年產(chǎn)量達(dá)6×107t[1],主要用于鮮食、釀酒、榨汁、曬干等。葡萄是我國(guó)的四大水果之一,其中70%以上用于鮮食。而葡萄果實(shí)細(xì)嫩多汁,易受致病菌侵染而腐爛,特別是在炎熱的收獲季節(jié)腐爛更為嚴(yán)重,貯藏和轉(zhuǎn)運(yùn)期間的保鮮直接影響果實(shí)品質(zhì),因此,建立安全高效的保鮮技術(shù)對(duì)鮮食葡萄產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要。

自1925年[2]用SO2熏蒸貯藏葡萄取得顯著效果以來,SO2類保鮮劑就被廣泛應(yīng)用于鮮食葡萄產(chǎn)業(yè),在果實(shí)貯藏、運(yùn)銷中發(fā)揮了重要作用。SO2類保鮮劑可延緩果實(shí)生理衰老,抑制病害發(fā)生[3]。但是,傳統(tǒng)采用的SO2劑量較高,造成葡萄果實(shí)內(nèi)SO2殘留量較大,對(duì)人體健康不利[4-5]。近期有采用化學(xué)方法[6]、物理方法[7]以及生物保鮮膜法[8]等貯藏葡萄果實(shí)的嘗試,但其保鮮效果均不及SO2,SO2類保鮮劑仍是當(dāng)前葡萄貯藏期間最為有效的防腐保鮮劑[9]。為降低SO2殘留,研究人員嘗試低劑量、短期或間歇式SO2熏氣等方式保鮮葡萄果實(shí),在新疆紅地球葡萄和無核白葡萄上取得了明顯效果[10-12]。不同品種葡萄對(duì)SO2敏感性不同,采后生理亦存在一定差異,需要選擇各自適合的SO2熏氣貯藏方式。

低溫可降低果實(shí)生理活動(dòng),延緩果實(shí)衰老速度,并有效抑制病原菌的發(fā)生及危害[13],是常用的保鮮措施之一。適當(dāng)降低葡萄貯藏溫度,對(duì)抑制果實(shí)采后生理衰老和病害發(fā)生會(huì)產(chǎn)生雙重調(diào)節(jié)作用,目前SO2結(jié)合低溫是葡萄采后保鮮最為有效的手段[9,14]。

灰霉菌(Botrytiscinerea)是引起葡萄果實(shí)采后腐爛的主要致病菌,其適應(yīng)性強(qiáng),在低溫下仍能生長(zhǎng),具有潛伏侵染和低溫致病的特點(diǎn)。為此,本研究以鮮食玫瑰香葡萄(VitisviniferaL.,Muscat Hamburg)為實(shí)驗(yàn)材料,從其表面分離出主要致病菌灰霉菌,研究了模擬貯藏條件下SO2類保鮮劑對(duì)灰霉菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響,分析了SO2類保鮮劑的抑菌效應(yīng),以期為低硫保鮮技術(shù)的建立提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰香葡萄 采自本地葡萄園;灰霉菌 由本實(shí)驗(yàn)室在采后腐爛的葡萄果實(shí)上分離純化得到;焦亞硫酸鈉 分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉 分析純,北京化工廠;速釋葡萄保鮮紙、控釋葡萄保鮮片 均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所提供。

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LS-50HD型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;THE-C恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;303-2電熱培養(yǎng)箱 南通縣金沙自動(dòng)化儀表廠;GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SC-350立式冷藏柜 青島海爾特種電冰柜有限公司;DPT2顯微鏡 OLYMPLUS;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;PTM400型SO2氣體分析儀 北京兄弟智達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玫瑰香葡萄的處理及指標(biāo)測(cè)定

1.2.1.1 玫瑰香葡萄預(yù)處理 剪除機(jī)械損傷果粒,選色度一致的果實(shí)置于內(nèi)襯PE保鮮袋的塑料箱中,按每箱5 kg分裝,于0 ℃預(yù)冷12 h后,SO2保鮮組每箱內(nèi)放1/4張葡萄速釋保鮮紙(含Na2S2O5約1.2 g)和8包葡萄控釋保鮮片(含Na2S2O5約6.8 g),對(duì)照組不放藥劑,扎緊塑料袋口,于-1～0 ℃冷庫(kù)中貯藏。

1.2.1.2 SO2濃度的測(cè)定 采用SO2氣體分析儀,在貯藏期間,0～40 d內(nèi)每隔5 d測(cè)定葡萄保鮮袋內(nèi)的SO2濃度,之后每隔10 d測(cè)定SO2濃度,繪制SO2濃度曲線。

1.2.1.3 葡萄表面pH的測(cè)定 采用酸性精密pH試紙,檢測(cè)貯藏60 d時(shí)葡萄表面水滴的pH。

1.2.1.4 微生物數(shù)量與種類的測(cè)定 選貯藏60 d的葡萄果穗,從對(duì)照組和SO2處理組中各取大小相同、外形完好的葡萄果粒10粒,連同果柄剪下,放入無菌培養(yǎng)皿中,用5 mL無菌水沖洗表面,取沖洗液測(cè)量560 nm處的光密度值,并取沖洗液200 μL涂于PDA平板上,25 ℃培養(yǎng),觀察菌落特征[15]。

1.2.2 離體實(shí)驗(yàn)及指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 孢子懸浮液的制備 前期課題組從貯藏的玫瑰香葡萄果實(shí)上分離并鑒定(生理生化和分子鑒定)了致病菌灰霉菌。從剛長(zhǎng)滿灰霉菌的平板上取直徑為5 mm菌餅,移植于新的PDA培養(yǎng)基上,于25 ℃培養(yǎng)5 d后,加少量無菌水沖洗平皿,收集孢子,制成濃度為1×106個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液。

1.2.2.2 不同pH和時(shí)間條件下菌落直徑的測(cè)定 選用300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液測(cè)試抑菌效果。參照貯藏期間葡萄果實(shí)表面pH[16],用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液模擬葡萄表面酸性環(huán)境,配制pH3.00和pH4.00的焦亞硫酸鈉溶液。用pH3.00和pH4.00、濃度為300 mg/L和600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液于25 ℃、150 r/min孵育灰霉菌孢子(孢子濃度為0.5×106個(gè)/mL)1、3、5 h,對(duì)照組用相同pH、不含焦亞硫酸鈉的緩沖液孵育孢子。孵育結(jié)束后,取孢子懸液5 μL接種于PDA平板中央,置于25 ℃培養(yǎng),觀察48 h內(nèi)菌絲生長(zhǎng)情況,測(cè)量菌絲直徑。

1.2.2.3 不同溫度條件下菌落直徑的測(cè)定 用pH3.00濃度為300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液于25 ℃、150 r/min孵育孢子1 h,對(duì)照組采用相同pH、不含焦亞硫酸鈉的緩沖液孵育孢子。孵育結(jié)束后,取孢子懸液5 μL接種于PDA培養(yǎng)基中央,分別于25 ℃和4 ℃培養(yǎng),觀察和測(cè)量菌絲直徑。

1.2.2.4 不同焦亞硫酸鈉濃度及溫度條件下孢子萌發(fā)情況的測(cè)定 用pH4.00濃度為0、300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉溶液于25 ℃孵育1 h的孢子10 μL,于PDA培養(yǎng)基(2 cm×2 cm,厚2 mm)上涂布均勻,于25 ℃和4 ℃培養(yǎng),并在顯微鏡下(40×)每隔6 h觀察記錄孢子形態(tài)及萌發(fā)情況,以芽管長(zhǎng)度≥孢子短半徑視為萌發(fā),每組觀察500個(gè)孢子,每個(gè)處理設(shè)2個(gè)平行,并記錄各組孢子最大萌發(fā)率及所需時(shí)間。最大萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,用鄧肯氏多重比較方法進(jìn)行不同處理組之間的差異顯著性檢驗(yàn),不同字母代表差異顯著(p<0.05),相同字母表示差異不顯著。利用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SO2熏氣濃度及對(duì)葡萄表面pH和微生物數(shù)量的影響

圖1 貯藏期間SO2濃度及葡萄表面pH變化

2.1.2 SO2對(duì)葡萄果實(shí)表面微生物的影響 由圖2可知,貯藏60 d后對(duì)照組(好果率低于75%[17])果實(shí)表面可培養(yǎng)微生物種群和數(shù)量顯著(p<0.05)多于SO2保鮮組。分離純化培養(yǎng)后,經(jīng)菌落形態(tài)和回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,灰霉菌為其中的優(yōu)勢(shì)菌群(圖2A,C)。SO2保鮮組(好果率大于95%[17])果實(shí)表面微生物總量很少(圖2C),可培養(yǎng)的微生物的數(shù)量和種類均較少,且未發(fā)現(xiàn)灰霉菌(圖2B)。

圖2 SO2對(duì)玫瑰香葡萄果實(shí)表面菌數(shù)/菌群的影響

2.2 焦亞硫酸鈉抑菌效應(yīng)及影響因素

2.2.1 pH和時(shí)間對(duì)灰霉菌菌落直徑的影響 由圖3可知,25 ℃條件下,以焦亞硫酸鈉處理孢子3 h為例,在pH4.00、300 mg/L焦亞硫酸鈉處理中致病菌生長(zhǎng)不能完全抑制,焦亞硫酸鈉濃度提高至600 mg/L時(shí)可完全抑制病菌生長(zhǎng),600 mg/L的抑菌強(qiáng)度大于300 mg/L,而pH3.00的300 mg/L焦亞硫酸鈉可完全抑制病菌生長(zhǎng)。由此可見,在相同溫度及處理時(shí)間下,對(duì)于SO2處理組，降低環(huán)境pH,可顯著提高低劑量焦亞硫酸鈉的抑菌效力,對(duì)抑菌有積極作用(p<0.05)。

由圖3可知,25 ℃條件下,以pH4.00、300 mg/L焦亞硫酸鈉處理組為例,作用孢子1 h,與對(duì)照組相比,抑菌效果差異顯著(p<0.05);作用孢子3 h,菌絲生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)36 h才出現(xiàn)菌絲,與對(duì)照組差異顯著(p<0.05);作用孢子5 h,處理組完全抑制病菌菌絲生長(zhǎng),與對(duì)照組差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明,在相同溫度及pH條件下,焦亞硫酸鈉孵育孢子時(shí)間越長(zhǎng),抑制效果越明顯,即焦亞硫酸鈉對(duì)灰霉菌的抑制作用具有時(shí)間依賴性。

由圖3可知,pH4.00焦亞硫酸鈉處理組在25 ℃培養(yǎng)條件下的菌絲直徑顯著大于pH3.00組(p<0.05),說明適當(dāng)降低pH能夠顯著增強(qiáng)SO2類保鮮劑的抑菌效果。焦亞硫酸鈉高劑量短時(shí)間處理與低劑量長(zhǎng)時(shí)間處理可達(dá)到相同的抑菌效果,一定條件下焦亞硫酸鈉可以完全抑制灰霉菌的發(fā)生。

圖3 pH和時(shí)間對(duì)灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2.2 溫度對(duì)灰霉菌菌落直徑的影響 比較圖4A和圖4B可知,pH3.00、300 mg/L焦亞硫酸鈉處理組作用孢子1 h,4 ℃培養(yǎng)下菌絲直徑顯著(p<0.05)小于25 ℃時(shí)。4 ℃條件下處理組45 d內(nèi)平板上無可見菌絲,差異顯著(p<0.05),說明孢子萌發(fā)被完全抑制。結(jié)果表明,降低環(huán)境溫度可顯著提高焦亞硫酸鈉的抑菌效力,焦亞硫酸鈉處理結(jié)合低溫貯藏可顯著提高抑菌效果,其中對(duì)孢子萌發(fā)的抑制在灰霉菌控制中發(fā)揮了決定性作用。

圖4 溫度對(duì)灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2.3 焦亞硫酸鈉濃度及溫度對(duì)灰霉菌孢子萌發(fā)的影響 顯微鏡下對(duì)照組孢子大小均一,呈規(guī)則的圓形或橢圓形,焦亞硫酸鈉處理組孢子大小不一,有棱角,形態(tài)不規(guī)則(圖5),說明焦亞硫酸鈉對(duì)灰霉菌的孢子產(chǎn)生了毒害作用,破壞了孢子形態(tài),影響了孢子活力,致使孢子不萌發(fā)或遲萌發(fā),并對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。

圖5 焦亞硫酸鈉對(duì)灰霉菌孢子形態(tài)的影響

檢測(cè)焦亞硫酸鈉對(duì)孢子萌發(fā)的影響發(fā)現(xiàn),用pH4.00、濃度為0、300、600 mg/L的焦亞硫酸鈉孵育灰霉菌孢子1 h后平板培養(yǎng),25 ℃條件下,分別培養(yǎng)6.25、12、31 h后,達(dá)到最大萌發(fā)率分別為100%、24%和11%;4 ℃條件下,分別培養(yǎng)54、312、432 h后,達(dá)到最大萌發(fā)率分別為92%、13%和6%。焦亞硫酸鈉處理組的孢子最大萌發(fā)率與對(duì)照組間存在顯著差異(p<0.05),萌發(fā)率降低76%～89%,但300 mg/L與600 mg/L焦亞硫酸鈉組間僅相差7%～13%。結(jié)果表明,降低溫度可使灰霉菌孢子延遲萌發(fā)或不萌發(fā),結(jié)合低溫貯藏,較低濃度焦亞硫酸鈉處理組可有效抑制灰霉菌孢子的萌發(fā)。

表1 焦亞硫酸鈉對(duì)灰霉菌孢子最大萌發(fā)率的影響

3 結(jié)論與討論

本研究以玫瑰香葡萄為實(shí)驗(yàn)材料,從果皮中分離出其貯藏期間主要的致病菌灰霉菌,證實(shí)SO2保鮮過程與其抑制果實(shí)表面微生物活性和防止致病菌產(chǎn)生有直接關(guān)系。進(jìn)而研究了不同pH、作用時(shí)間以及溫度條件下焦亞硫酸鈉對(duì)灰霉菌抑菌效果的影響。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),焦亞硫酸鈉處理組灰霉菌孢子萌發(fā)率和菌落直徑均顯著低于對(duì)照組(p<0.05),抑菌效應(yīng)與作用時(shí)間、pH和溫度直接相關(guān)。隨著焦亞硫酸鈉濃度升高,作用時(shí)間延長(zhǎng),抑菌作用顯著增強(qiáng)(p<0.05)。降低環(huán)境pH并結(jié)合低溫貯藏,可增強(qiáng)低濃度焦亞硫酸鈉的抑菌效力。本研究中用pH3.00的焦亞硫酸鈉300 mg/L處理菌孢子后在冷藏溫度下灰霉菌不能萌發(fā)和生長(zhǎng)。因此,為降低果實(shí)中硫殘留,可選擇較低濃度保鮮劑與適當(dāng)?shù)馁A藏溫度、pH環(huán)境匹配組合以實(shí)現(xiàn)對(duì)鮮食葡萄的貯藏保鮮。

SO2、過氧化氫、臭氧等均能抑菌殺菌,但過氧化氫、臭氧對(duì)葡萄的保鮮效果遠(yuǎn)不及SO2[9]。SO2類保鮮劑作為目前最有效的葡萄果實(shí)采后保鮮劑,其保鮮作用可能還與其能誘導(dǎo)果實(shí)組織產(chǎn)生抗性有關(guān)[22],具體保鮮機(jī)制有待進(jìn)一步研究。為降低果實(shí)中的硫殘留,采用較低pH,低劑量SO2短期處理結(jié)合低溫條件來貯藏葡萄果實(shí)不失為一種良策。本文的研究結(jié)果為葡萄保鮮實(shí)踐提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1]Teixeira A,Baenas N,Dominguez-perles R,et al. Natural bioactive compounds from winery by-products as health promoters:a review[J]. Molecular Sciences,2014,15(9):15638-15678.

[2]Winker A J,Jacob H E. The utilization of sulfur dioxide in the marketing grapes[J].Hilgardia,1925(1):107-131.

[3]趙猛,馮志宏,王春生. 國(guó)內(nèi)外葡萄貯藏保鮮技術(shù)及山西省葡萄產(chǎn)業(yè)化貯藏技術(shù)進(jìn)展[J]. 山西果樹,2016(2):21-23.

[4]Artes-hernandez F,Tomas-barberan F A,Artes F. Modified atmosphere packaging preserves quality of SO2-free ‘Superior seedless’ table grapes[J]. Postharvest Biology and Technology,2006,39(2):146-154.

[5]Ding Lulong,Yang Xiangzheng,Li Xihong,et al. Effect of SO2interval fumigation on storage quality of red grape[J]. Applied Mechanics and Materials,2013,411(8):3170-3173.

[6]Jiang L,Jin P,Wang L,et al. Methyl jasmonate primes defense responses against Botrytis cinerea and reduces disease development in harvested table grapes[J]. Scientia Horticulturae,2015,192,218-223.

[7]Teles C S,Benedetti B C,Gubler W D,et al. Prestorage application of high carbon dioxide combined with controlled atmosphere storage as a dual approach to control Botrytis cinerea in organic ‘Flame Seedless’ and ‘Crimson Seedless’ table grapes[J]. Postharvest Biology and Technology,2014,89,32-39.

[8]Qin X.,Xiao H,Xue C,et al. Biocontrol of gray mold in grapes with the yeast Hanseniaspora uvarum alone and in combination with salicylic acid or sodium bicarbonate[J]. Postharvest Biology and Technology,2015,100:160-167.

[9]Giraud E,Ivanova A,Gordon C S,et al. Sulphur dioxide evokes a large scale reprogramming of the grape berry transcriptome associated with oxidative signalling and biotic defence responses[J]. Plant,Cell and Environment,2012,35(2):405-417.

[10]趙飛,張平,朱志強(qiáng),等. SO2氣態(tài)熏蒸結(jié)合固態(tài)緩釋保鮮劑處理對(duì)紅地球葡萄貯藏品質(zhì)的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2013(12):182-186.

[11]周江,魏佳,張輝,等. 二氧化硫(SO2)間歇熏蒸對(duì)紅地球葡萄貯藏品質(zhì)的影響[J]. 食品科技,2015(12):295-299.

[12]王寧,鄧冰,李珍,等. 低溫貯藏結(jié)合SO2保鮮劑對(duì)無核白葡萄保鮮效果研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016(6):330-334,345.

[13]劉亮,陳偉,楊震峰,等. 貯藏溫度對(duì)葡萄果實(shí)采后抗氧化活性的影響及動(dòng)力學(xué)分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(4):134-139.

[14]張亞洲,李喜宏,劉霞,等. 溫度及SO2處理對(duì)采后葡萄灰霉菌抑制作用研究[J]. 中國(guó)果樹,2016(1):42-46.

[15]劉麗青,王燕楠,儀慧蘭,等. 二氧化硫?qū)γ倒逑闫咸压麑?shí)采后保鮮的機(jī)理[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2016,22(2):0338-0341.

[16]喬瑞芳,儀民,儀慧蘭. 焦亞硫酸鈉對(duì)酵母細(xì)胞的毒性作用[J]. 食品科學(xué),2015,36(21):10-14.

[17]Xue Meizhao,Yi Huilan. Induction of disease resistance providing new insight into sulfur dioxide preservation inVitisviniferaL.[J]. Scientia Horticulturae,2017,225:567-573.

[18]Yi Huilan,Yin Jingjing,Liu Xin,et al. Sulfur dioxide induced programmed cell death in Vicia guard cells[J]. Ecotoxicology and Environment Safety,2012,78:281-286.

[19]儀慧蘭,姜林. SO2水合物誘發(fā)蠶豆(Vicia faba)根尖細(xì)胞染色體畸變效應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào),2007,27(6):2318-2324.

[20]周澤寧,姜愛麗,胡文忠,等. 焦亞硫酸鈉溶液處理對(duì)采后紅地球葡萄生理代謝及安全性的影響[J]. 保鮮與加工,2015,15(2):18-24.

[21]潘艷芳,王威,張亞洲. 焦亞硫酸鈉浸泡處理對(duì)紅提葡萄貯藏效果的影響[J]. 中國(guó)果菜,2014(10):8-11.

[22]劉麗青,儀慧蘭. SO2處理激活龍眼葡萄果實(shí)采后防御應(yīng)答[J]. 食品科學(xué),2015,36(18):209-212.