AMDIS-SPME-GC/MS分析不同產(chǎn)地魚露中的揮發(fā)性物質(zhì)

付 奧,趙 利,袁美蘭,劉 華,江 勇

(江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330013)

魚露是以魚蝦或水產(chǎn)品加工的下腳料為原料,經(jīng)發(fā)酵分解而成的一種調(diào)味品。不同產(chǎn)地的魚露因原料、發(fā)酵程度、氣候等差異而呈現(xiàn)出獨(dú)特而多元的氣味,深受消費(fèi)者喜愛。目前對魚露的研究多集中在制備工藝[1-3]和生化特性[4-5]等方面,對魚露中揮發(fā)性物質(zhì)的研究多集中在分析魚露中的某一種揮發(fā)性物質(zhì)[6-7]。揮發(fā)性物質(zhì)是魚露品質(zhì)的重要指標(biāo),揮發(fā)性物質(zhì)成分的種類、濃度、閾值和彼此間的相互作用賦予了魚露特有的香味,故對不同產(chǎn)地的魚露中的揮發(fā)性物質(zhì)的研究就顯得十分有必要。

頂空固相微萃取技術(shù)(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)已成功運(yùn)用于多種食品[8-12]的揮發(fā)性物質(zhì)的萃取。氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)與自動質(zhì)譜解卷積定性系統(tǒng)(Automatic mass spectral deconvolution and identification system,AMDIS)、保留指數(shù)(Retention index,RI)聯(lián)用已成為復(fù)雜樣品中多組分準(zhǔn)確定性的重要手段,應(yīng)用于檢測人工麝香[13]、花椒與青椒[14]、麩炒白術(shù)[15]、花椒飲片[16]等揮發(fā)性物質(zhì)的分析。

魚露基質(zhì)復(fù)雜,無論如何優(yōu)化色譜條件,總存在一些保留時(shí)間相近的物質(zhì),在總離子流圖上完全或部分重疊,影響質(zhì)譜定性結(jié)果,而AMDIS對重疊峰、雜峰和低濃度物質(zhì)有較強(qiáng)的解卷積能力。AMDIS對色譜峰解析后,進(jìn)行NIST譜庫的自動搜索,其結(jié)果并不能確定為最終的定性結(jié)果,需要通過RI值進(jìn)一步確認(rèn)。RI值僅與固定相有關(guān),當(dāng)采用同一類型色譜柱時(shí),計(jì)算RI值與參考文獻(xiàn)RI值誤差在±3%以內(nèi),則認(rèn)為該物質(zhì)定性可靠,因而將GC-MS 與AMDIS、RI結(jié)合能更準(zhǔn)確的對揮發(fā)性物質(zhì)定性。對多個(gè)樣品進(jìn)行比較分析時(shí),需要進(jìn)行峰對齊。由于色譜峰數(shù)量太大,采用人工方式需要耗費(fèi)大量時(shí)間。一些具有峰對齊功能的軟件被用于多樣品的色譜分析,當(dāng)一些軟件進(jìn)行同組但不同批號的樣品分析結(jié)果對比研究,若某種化合物僅在幾個(gè)批號樣品中被檢測到而不是全部樣品時(shí),這種化合物可能會被丟失,也可能會被替換,這樣就會生成一份由有缺失值的分析結(jié)果。GAVIN(Assignment Validator and Integrator)則能有效地解決這一缺陷,能將多個(gè)樣品的色譜分析結(jié)果(包括積分峰面積、保留時(shí)間、名稱和凈分?jǐn)?shù)等)匯總為一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣,作為目視檢查和回填的起點(diǎn)數(shù)據(jù),對比檢測每個(gè)單一樣品中的缺失值,能有效減少AMDIS軟件分析結(jié)果的缺失值[17],而且用戶可以自定義一定閾值,這個(gè)閾值可以決定了在一定百分比的樣本中找到某個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)的閾值為50,即同一產(chǎn)地的某種揮發(fā)性物質(zhì)只有在同一組50%以上的樣品中被檢測出才會在結(jié)果中被保留。

本文收集了廣東、泰國、越南產(chǎn)地的魚露和本實(shí)驗(yàn)室自制的魚露,將HS-SPME-GC-MS和AMDIS、GAVIN、RI結(jié)合,對不同產(chǎn)地魚露中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行比較,同時(shí)采用模式識別技術(shù)分析不同產(chǎn)地魚露的共有峰,為進(jìn)一步深入研究魚露風(fēng)味物質(zhì)的生成機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚露 來自廣東、實(shí)驗(yàn)室自制[18]、越南、泰國,見表1,分別用gd、yl、yn、tg1、tg2表示,每種魚露各有6個(gè)不同批號,均在保質(zhì)期內(nèi);NaCl(分析純) 上海綠源精細(xì)化工廠;C 5～C 44正構(gòu)烷烴混合對照品 美國Restek公司。

表1 5種魚露樣品信息

QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;Rtx-5 MS 30 mm×0.25 mm i. d.×0.10 μm石英毛細(xì)柱 美國Restek公司;AOC-5000型頂空-固相微萃取三合一自動進(jìn)樣器 瑞士CTC公司;85 μm聚丙烯酸酯(polyacrylate,PA)萃取頭 美國Supelco公司;20 mL頂空瓶 美國Alltech公司;20 mm含PTFE/藍(lán)色硅膠蓋墊磁性蓋 德國CNW Technologles Gmbh。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件[7],移取5 mL魚露樣品于20 mL頂空瓶,加入5 g NaCl后,置于自動進(jìn)樣器中,在優(yōu)化的條件即萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間40 min和振蕩頻率500 r/min的條件下進(jìn)行HS-SPME,之后將萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口解吸5 min,進(jìn)行GC-MS分析。每組樣品分別測6次不同批號的樣品。

1.2.1 色譜條件 載氣:He(99.999%);柱前壓:50.4 kPa;進(jìn)樣溫度:250 ℃;程序升溫:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至150 ℃,20 ℃/min升至300 ℃并保持4 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子化方式為電子轟擊(electron impact ionization,EI),離子源溫度:230 ℃,接口溫度:260 ℃,初始狀態(tài)為不分流進(jìn)樣,2 min后打開分流閥,分流比例20∶1;溶劑延遲:2.5 min;監(jiān)測方式為全掃描方式,掃描范圍:50～350 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)分析

GAVIN結(jié)合AMDIS被用于不同魚露的揮發(fā)性的鑒定。所獲總離子流圖(Total ion chromatogram,TIC)的色譜峰,以CDF格式保存,并經(jīng)AMDIS進(jìn)行自動解卷積處理和NIST譜庫檢索,要求正逆匹配度在700以上,在NIST網(wǎng)站(http://webbook. nist. gov/chemistry/name-ser. html)中搜索文獻(xiàn)，結(jié)合文獻(xiàn)檢索對比該化合物的相對保留指數(shù)(RI),當(dāng)計(jì)算RI值與參考文獻(xiàn)RI值誤差在±3%以內(nèi),則認(rèn)為該物質(zhì)定性可靠。所有TIC經(jīng)AMDIS處理后產(chǎn)生CDF文件;萃取溶劑、平行測定等信息的元數(shù)據(jù);GC-MS數(shù)據(jù)經(jīng)AMDIS處理后產(chǎn)生包含樣品揮發(fā)性物質(zhì)峰面積,保留時(shí)間、名稱等信息的FIN和FIN文件中數(shù)據(jù)經(jīng)提前后與數(shù)據(jù)庫中的離子匹配的結(jié)果數(shù)據(jù);將它們導(dǎo)入Matlab,經(jīng)GAVIN進(jìn)行峰對齊,并自動形成數(shù)據(jù)矩陣,其每一行為所有樣品同一成分的峰面積,每一列為不同樣品。以上4組數(shù)據(jù)匯總的數(shù)據(jù)矩陣作為起點(diǎn)數(shù)據(jù),會回填每個(gè)產(chǎn)地不同批號魚露樣品中的缺失值,最后GAVIN從這些數(shù)據(jù)中提取出樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)圖譜、保留時(shí)間、定量離子及平行樣品中的檢查的所有揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量等信息,最終生成一個(gè)結(jié)果數(shù)據(jù)矩陣來用于AMDIS的揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)果鑒定。5種魚露中的共有揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PCA(Principal Component Analysis,PCA)分析,以區(qū)分不同產(chǎn)地魚露。GAVIN和PCA均為在Matlab 7.0版本上編寫的腳本。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)物定性和峰對齊

圖1為不同產(chǎn)地魚露的總離子流圖,由圖可知gd魚露樣品出峰時(shí)間主要集中在20～30 min,tg1和tg2魚露樣品的出峰時(shí)間主要集中在0～13 min和20～30 min,yl魚露樣品的出峰時(shí)間主要分布在5～33 min,yn魚露樣品的出峰時(shí)間分布在3～30 min,五種魚露樣品的TIC圖在響應(yīng)豐度上有著直觀差異,這是由于不同魚露樣品中揮發(fā)性化合物及其濃度不同而導(dǎo)致。但由圖可看出在3、13、27 min附近,五種魚露均有出峰,這表明不同產(chǎn)地魚露樣品間存在著共有揮發(fā)性物質(zhì)。

圖1 五種魚露樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子圖

所有魚露樣品經(jīng)過Volker[17]在Matlab平臺上編寫GAVIN腳本,將多個(gè)AMDIS 文件的結(jié)果合并,自動進(jìn)行峰對齊,產(chǎn)生一個(gè)供多元統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)矩陣。

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)

5種魚露樣品檢測的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)AMDIS和GAVIN處理后,在NIST普庫中一共確定93種揮發(fā)性物質(zhì),結(jié)果見表2。其中硫醚類物質(zhì)1種,酸類物質(zhì)12種,醛類物質(zhì)3種,醇類物質(zhì)13種,硫類物質(zhì)1種,醚類物質(zhì)1種,酮類物質(zhì)9種,烴類物質(zhì)10種,酯類物質(zhì)12種,雜環(huán)類物質(zhì)6種,芳香類物質(zhì)25種。

表2 HS-SPME-GC-MS法測定5種魚露中揮發(fā)性成分

續(xù)表

在yl魚露樣品中鑒定出53種揮發(fā)性物質(zhì),其中相對百分含量較高的是醋酸(13.06%)和2-呋喃甲醇(5.87%),其他一些代表性揮發(fā)物分別是丁酸(0.26%)和丁烯酮(0.18%),一些僅在yl中鑒定出來的揮發(fā)性物質(zhì)分別是乙基異丙基硫醚、二十烷、呋喃、十五醇、吡啶、丙位癸內(nèi)酯、十四酸乙酯、十七烷酸乙酯、鄰甲酚、四氫萘酚、丙氧基苯、對甲氧基苯。yn、tg1和tg2魚露樣品分別鑒定出了51、47和45中揮發(fā)性物質(zhì)。

yn魚露樣品中主要揮發(fā)性物質(zhì)是2,4-二叔丁基苯酚(22.72%)和十四烷酸(12.68%),其他代表性揮發(fā)性物質(zhì)是庚酸(4.92%)和2-十一酮(0.10%),僅在yn樣品中鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)是3-甲基戊酸、氫化肉桂酸、正癸酸、異十九烷、三甲基吡嗪、2-乙基-3-(鉀硫基)吡嗪、己酸異戊酯、3.5-二甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚、對甲氧基苯酚、丁香酚。

來自同一品牌的tg1和tg2魚露樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)種類相似,其中相對百分含量較高的物質(zhì)是2,4-二叔丁基苯酚(56.71%)和苯酚(15.95%),tg樣品中獨(dú)有揮發(fā)性物質(zhì)有4種,其中3-甲基十二烷、苯丙酮在tg1樣品中被鑒定出,N-(3-氯-2-氟苯甲酰)-丙氨酸戊酯、1-苯基萘在tg2中被鑒定出。

五種魚露樣品中,gd魚露樣品中鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)最少,44種。其中揮發(fā)性物質(zhì)相對含量較高的物質(zhì)是2,4-二叔丁基苯酚(44.75%)和苯酚(31.82%),其他一些代表物質(zhì)分別是4-甲基苯酚(0.03%)和1-萘酚(0.01%),僅在gd樣品中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)是苯乙烯、2-莰醇、1-甲基-4-(1-甲基乙基)環(huán)己醇、2,2-二甲基-3-(3-甲基苯基)丙醇、2,2-二苯基乙醇、1-苯基-2-丙酮、5-甲基-2-乙酰基呋喃、1,2-二甲基萘。

魚露樣品中的獨(dú)有組分均未見報(bào)告,表明AMDIS能通過解卷積來拆解來重疊峰和低濃度物質(zhì),為揮發(fā)性物質(zhì)的定性提供幫助。魚露中的一些揮發(fā)性前體物質(zhì)是由氨基酸或者脂肪酸在酶或微生物的影響下和降解過程中共形成的,但由于生產(chǎn)魚露的原料魚類,發(fā)酵的微生物種類以及酶解途徑等因素對魚露中特征揮發(fā)性物質(zhì)的形成有很大影響,所以現(xiàn)代規(guī)模化生產(chǎn)的魚露存在風(fēng)味異變的問題[19]。

gd魚露樣品中酯類和芳香類揮發(fā)性物質(zhì)相對百分比含量比其他產(chǎn)地魚露樣品中含量高,分別為9.64%和76.8%。酯類揮發(fā)性物質(zhì)是魚露在發(fā)酵過程中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物而生成的醇和羧酸的酯化作用而形成[20],多呈果香和花香味,且閾值較低,,能賦予魚露甜香、水果香、花香[21-22]。不同產(chǎn)地魚露中的主要酯類揮發(fā)性物質(zhì)是酞酸二甲酯和1,2-苯二甲酸二丁酯,其最高相對百分比含量分別在gd和yn魚露樣品中檢測出,是4.39%和6.33%。芳香類揮發(fā)性物質(zhì)形成原因較為復(fù)雜,但此類揮發(fā)性物質(zhì)閾值較低,是食品的特征風(fēng)味的重要組成,如愈創(chuàng)木酚具有煙味和甜味;吲哚類物質(zhì)呈花香味[23]。不同產(chǎn)地魚露中主要芳香類揮發(fā)性物質(zhì)是苯酚、和2,4-二叔丁基苯酚,其最高相對百分比含量分別在gd和tg1魚露樣品中檢測出,分別是31.82%和56.71%。

tg魚露樣品中酮類揮發(fā)性物質(zhì)相對百分比含量比其他產(chǎn)地魚露樣品中含量高,tg1和tg2魚露樣品分別為2.41%和2.37%。酮類揮發(fā)性物質(zhì)與多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解、氨基酸降解等有關(guān)[24],具有花香和果香味,且閾值高,對食品的整體甜的花香和果香風(fēng)味有增強(qiáng)作用[25]。不同產(chǎn)地魚露樣品中的主要酮類揮發(fā)性物質(zhì)是乙位紫羅蘭酮和二苯甲酮,其最高相對百分比含量分別在gd和tg2魚露樣品中檢測出,是0.80%和1.22%。苯乙酮在5種魚露樣品中均被檢測出,與徐偉[26]檢測結(jié)果一致。

yn魚露樣品中酸類和雜環(huán)類揮發(fā)性物質(zhì)相對百分比含量比其他產(chǎn)地魚露樣品中含量高,分別是41.75%和5.45%。酸類揮發(fā)性物質(zhì)是由脂肪的水解以及脂肪氧化過程中產(chǎn)生[27],大多帶有腐敗、汗味或令人作嘔的不愉快氣味,閾值較高,對魚露整體風(fēng)味有不良影響。不同產(chǎn)地魚露樣品中主要酸類揮發(fā)性物質(zhì)是醋酸、十四烷酸,其最高相對百分比含量分別在yl和yn魚露樣品中檢測出,是13.06%和12.68%。此外與徐偉等[26]和江津津等[28]報(bào)道結(jié)果一致,辛酸、丙酸、丁酸、戊酸也在魚露樣品中被檢測出。雜環(huán)類揮發(fā)性物質(zhì)形成原因較為復(fù)雜,但此類揮發(fā)性物質(zhì)閾值較低,是食品的特征風(fēng)味的重要組成,如吡嗪雜環(huán),是脂肪氧化物參與美拉德反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)物,具有堅(jiān)果香味和烤香味[29],是蝦醬類食品的特征物質(zhì)[30]。2-乙基-6-甲基吡嗪與2,6-二甲基吡嗪與其他學(xué)者在魚醬油中檢測結(jié)果一致[26,28]。

yl魚露樣品中烴類、醛類和醇類揮發(fā)性物質(zhì)相對百分比含量比其他產(chǎn)地魚露樣品中含量高,分別是7.99%、3.36%和14.44%。烴類揮發(fā)性物質(zhì)是脂肪酸氧化自由基的均裂所致[31],大多帶清香和香甜味,閾值和含量均較低,對魚露的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[32]。不同產(chǎn)地魚露樣品中主要烴類揮發(fā)性物質(zhì)是十七烷和二十烷,其最高相對百分比含量在yl魚露樣品中檢測出,是5.38%和2.12%。醛類揮發(fā)性物質(zhì)是多不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下氧化降解產(chǎn)生[33],與魚露發(fā)酵過程中的酵母代謝產(chǎn)物有關(guān),會產(chǎn)生令人愉悅的氣味閾值低,對食品的整體風(fēng)味有重要影響[34]。不同產(chǎn)地魚露樣品中主要烴類揮發(fā)性物質(zhì)是苯甲醛和苯乙醛,其最高相對百分比含量分別在gd和yl魚露樣品中檢測出,是1.05%和1.93%。醇類揮發(fā)性物質(zhì)是脂肪酸二級氫過氧化物的分解、脂質(zhì)氧化酶對脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解生成,或由羰基化合物還原生成醇[24],大多呈香甜的果香,但閾值分布范圍較大。不同產(chǎn)地魚露樣品中主要醇類揮發(fā)性物質(zhì)是2-呋喃甲醇和苯乙醇,其最高相對百分比含量在yl魚露樣品中檢測出,是5.87%和4.17%。檢測結(jié)果與徐偉等[26]在低鹽魚醬油中的檢測結(jié)果一致。

2.3 主成分分析

5種魚露樣品的共有揮發(fā)性物中發(fā)現(xiàn)共有組分的相對含量都相對較低,大部分低于1%,除了gd、tg1、tg2樣品中的苯酚含量較高,相對百分比大于10%。這說明不同產(chǎn)地魚露的揮發(fā)性物質(zhì)在揮發(fā)性物質(zhì)上具有一定的相似性,但揮發(fā)性物質(zhì)的含量具有較大的差異性。為研究不同產(chǎn)地魚露中共有物質(zhì)對魚露產(chǎn)地區(qū)分的貢獻(xiàn)程度,對11種共有物質(zhì)的峰面積進(jìn)行PCA分析,由表3可知,五種魚露的11種共有物質(zhì)能很好的區(qū)分不同產(chǎn)地的魚露,其中PCA1的貢獻(xiàn)率是73.29%,PCA2的貢獻(xiàn)率是22.41%,兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了95.70%,表明魚露中的共有化學(xué)物質(zhì)是區(qū)分不同產(chǎn)地魚露樣品的主要成分。不同產(chǎn)地魚露在圖2中數(shù)據(jù)分散無重疊,表明雖然是魚露的共有組分,但不同產(chǎn)地的魚露樣品揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)過PCA降維后有明顯區(qū)別。11種共有組分做載荷分析,其中3、4、6、10號物質(zhì)即苯酚、2-乙基己醇、苯乙醇、α-氯乙酰苯,4種化合物對不同魚露樣品的區(qū)分貢獻(xiàn)較大。貢獻(xiàn)率越大表明它們在不同樣品魚露中的差異越大,形成這些揮發(fā)性的前體物質(zhì)大多都是非揮發(fā)性物質(zhì),如脂肪、氨基酸和短肽等,這些前體物質(zhì)差異性可能與生產(chǎn)魚露的原料有關(guān),也可能與發(fā)酵的鹽濃度和發(fā)酵菌種有關(guān)[35-36]。

表3 5種魚露樣品共有物質(zhì)PCA圖的主成成分貢獻(xiàn)率

圖2 5種魚露樣品共有物質(zhì)的PCA分析圖

3 結(jié)論

本文通過HS-SPME-GC-MS分析了不同產(chǎn)地魚露中的揮發(fā)性物質(zhì),TIC圖譜經(jīng)AMDIS解卷積處理,并經(jīng)RI值對比確認(rèn)后,最終定性了93種揮發(fā)性物質(zhì),硫醚類物質(zhì)1種,酸類物質(zhì)12種,醛類物質(zhì)4種,醇類物質(zhì)13種,硫類物質(zhì)1種,醚類物質(zhì)1種,酮類物質(zhì)9種,烴類物質(zhì)10種,酯類物質(zhì)12種,雜環(huán)類物質(zhì)5種,芳香類物質(zhì)25種。且不同產(chǎn)地魚露揮發(fā)性物質(zhì)差異較大,其中廣東魚露樣品中酯類和芳香類揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量高,泰國魚露樣品中酮類揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量高,越南魚露樣品中酸類和雜環(huán)類揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量高,實(shí)驗(yàn)室自制魚露樣品中烴類、醛類和醇類揮發(fā)性物質(zhì)相對含量高。將GAVIN與AMDIS結(jié)合分析魚露樣品的TIC圖譜,能夠自動進(jìn)行平行樣品色譜圖的的峰對齊,五種魚露中的獨(dú)有組分有35種,共有組分有11種。5種魚露樣品中的11種共有揮發(fā)性物質(zhì)的PCA和載荷分析表明,其共有揮發(fā)性組分在魚露樣品中的差異性較大,對區(qū)分不同產(chǎn)地的魚露有不同程度的貢獻(xiàn),能較好的區(qū)分不同魚露產(chǎn)地。本論文的研究的結(jié)果,為不同產(chǎn)地魚露的鑒別提供了分析方法,其分析手段也可用于其他多樣品TIC的比較分析。

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