黃花油點草總黃酮超聲提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及抗氧化性分析

閆 蕊,趙 樺

(陜西理工大學(xué),生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000)

黃花油點草(T.maculataMachride),又名紅酸七,為百合科油點草屬植物,主要分布于陜西、四川、貴州等地,多生于海拔280～2300 m的山坡或溝谷邊等處[1]。該植物在陜西分布很廣,是民間重要地方習(xí)用藥材,也是陜西“七藥”之一[2]。黃花油點草全草入藥,主要用于跌打損傷,具有活血化瘀、清熱解毒,平喘益氣、定神定志的功效[3-4]。目前,對黃花油點草的研究主要在其生殖生物學(xué)[5]、有效成分種類確定、藥理功效研究等方面[6-7],孫靜等[8]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物是黃花油點草的主要有效成分之一。

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物界的天然活性成分,具有擴張血管、抗氧化、抗癌等多種生物功效,近年來引起人們的廣泛關(guān)注[9-10]。目前,黃酮類化合物提取分離的主要方法有系統(tǒng)溶劑法、微波提取法、超臨界萃取法、超聲波提取法等,其中超聲波提取法具有高效、簡便、能耗低等特點,被廣泛應(yīng)用于黃酮類天然產(chǎn)物成分的提取[11]。本實驗采用響應(yīng)面法研究超聲輔助提取黃花油點草中總黃酮的最佳工藝,并采用鄰二氮菲法、DPPH法對黃花油點草的不同溶劑提取物抗氧化活性進行評價,以期為黃花油點草中黃酮類物質(zhì)的深入研究及綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃花油點草 于2016年、2017年采自陜西留壩紫柏山,經(jīng)陜西理工大學(xué)植物學(xué)教授楊培君老師鑒定為百合科黃花油點草;鄰菲啰啉 天津登峰化學(xué)試劑廠;抗壞血酸(VC) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、30%過氧化氫 天津盛奧化學(xué)試劑有限公司;2,2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH) Sigma-aldrich 公司;水 自制超純水;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海同田生物技術(shù)股份有限公司,批號為:15090721、14061322。

AB204-S型電子分析天平 瑞士 Mettler Toledo公司;島津UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司;722-光柵分光光度 上海分析儀器總廠;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;FW-177型中藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;UPH-II-10T型優(yōu)普超純水機 成都優(yōu)普凈化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃花油點草總黃酮提取工藝 黃花油點草莖桿于35 ℃條件下干燥至恒重,粉碎過65目篩,得黃花油點草粉。精密稱取黃花油點草粉0.5 g,37 ℃溫度下于索氏提取器中用乙醚脫脂3 h,取出樣品包揮干殘留乙醚。將脫脂后的樣品包置于50 mL錐形瓶,加入40 mL 50%乙醇,在一定條件下超聲提取,抽濾得總黃酮提取液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 提取溫度對黃花油點草總黃酮得率的影響 按照1.2.1方法,稱取黃花油點草粉末0.5 g,以50%乙醇為溶劑,在料液比1∶40 g/mL,超聲功率240 W、提取時間40 min下,以考察提取溫度(35、40、45、50、55 ℃)對黃花油點草的提取得率的影響。

1.2.2.2 提取時間對黃花油點草總黃酮得率的影響 按照1.2.1方法,精密稱取黃花油點草粉0.5 g,以50%乙醇為溶劑,在料液比1∶40 g/mL、超聲功率240 W、提取溫度45 ℃下,考察提取時間(30、40、50、60、70 min)對黃花油點草總黃酮得率的影響。

1.2.2.3 超聲功率對黃花油點草總黃酮得率的影響 按照1.2.1方法,精密稱取黃花油點草粉0.5 g,以50%乙醇為溶劑,在料液比1∶40 g/mL、超聲溫度45 ℃、提取時間40 min下,考察超聲功率(180、210、240、270、300 W)對黃花油點草總黃酮得率的影響。

1.2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃花油點草總黃酮得率的影響 按照1.2.1方法,精密稱取黃花油點草粉0.5 g,在料液比1∶40 g/mL、超聲溫度45 ℃、提取時間40 min下,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)對黃花油點草總黃酮得率的影響。

1.2.2.5 料液比對黃花油點草總黃酮得率的影響 按照1.2.1方法,精密稱取黃花油點草粉0.5 g,以50%乙醇為溶劑,在超聲功率240 W、提取溫度45 ℃、提取時間40 min下,考察料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL)對黃花油點草總黃酮得率的影響。

1.2.2.6 提取次數(shù)對黃花油點草總黃酮得率的影響 按照1.2.1方法,精密稱取黃花油點草粉0.5 g,以50%乙醇為溶劑,在超聲功率240 W、提取溫度45 ℃、提取時間40 min下,考察提取次數(shù)(1、2、3次)對黃花油點草總黃酮得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法實驗 在單因素分析的基礎(chǔ)上,以Box-Behnken的中心組合原理為依據(jù),以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、超聲功率(D)為自變量,總黃酮得率為因變量,采用4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化工藝,利用統(tǒng)計分析軟件Design expert 8.0.5建立數(shù)學(xué)回歸模型,確定黃花油點草總黃酮最佳提取工藝條件,實驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及樣品中總黃酮得率測定 準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品9.93 mg,置于25 mL容量瓶中,用50%乙醇配成0.3972 mg/mL蘆丁母液,依次量取一定量蘆丁母液放入25 mL容量瓶中稀釋定容,分別配成3.1776、7.944、15.888、31.776、47.664、63.552、79.44 μg/mL濃度的蘆丁對照品溶液(空白:不加蘆丁對照品溶液)。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法進行顯色,取適量待測液放置25 mL容量瓶中,加水到6 mL后,加入1 mL的5% NaNO2,搖勻靜置6 min后,加入1 mL的10% Al(NO3)3,搖勻靜置6 min后,加入10 mL的1 mol/L NaOH,用50%乙醇定容,靜置15 min,在波長為500 nm處紫外分光光度計下測定吸光值[13]。各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別檢測3次,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=0.011x-0.0037(R2=0.9999),在3.1776～79.44 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

按照1.2.1項下方法制備提取液,濾液定容于50 mL容量瓶中,吸取適量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法進行顯色并測定其吸光值。根據(jù)回歸方程,計算黃花油點草中總黃酮得率,公式如下:

式中:c為所測濃度(μg/mL);V為供試液體積(mL);m為樣品質(zhì)量(g);f為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 供試品溶液制備 以響應(yīng)面優(yōu)化后所得提取條件為參數(shù),按1.2.1項方法,以乙醇、甲醇和水為溶劑,提取制備用于黃花油點草抗氧化活性實驗的供試液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 羥自由基(·OH)清除率的測定 采用鄰二氮菲法測定羥自由基(·OH)的清除率,取1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液置于10 mL的刻度試管中,加入2 mL 0.2 mol/L pH7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS),混勻后加入1 mL 0.75 mmoL/L 的FeSO4溶液,充分混勻后加入1 mL不同濃度的供試液或VC溶液,再加入1 mL 0.01% H2O2溶液,然后加超純水補足到10 mL,混勻,在37 ℃水浴下反應(yīng)1 h后,在536 nm波長下測定吸光值A(chǔ)1(樣品管);同上法,不加入H2O2和供試液測定吸光值A(chǔ)0(未損害管);同上法不加入供試液測定吸收值A(chǔ)2(損害管),實驗重復(fù)3次,以平均值作為測定結(jié)果;采用不同濃度梯度的VC作為陽性對照組按照同法進行測試[14-15]。不同溶劑提取物對羥自由基(·OH)的清除率計算公式為:

1.2.5.3 DPPH(2,2-二苯基-1-苦苯肼)自由基清除率的測定 吸取不同濃度的供試液2 mL,分別加入2 mL DPPH溶液,充分混勻,避光反應(yīng)30 min,以無水乙醇為空白調(diào)零,在517 nm下測定其吸光值A(chǔ)1;吸取2 mL供試液與2 mL無水乙醇,充分混勻,避光反應(yīng)30 min,以無水乙醇為空白調(diào)零,在517 nm下測定其吸光值A(chǔ)2;吸取2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液充分混勻,避光反應(yīng)30 min,以無水乙醇為空白調(diào)零,在517 nm下測定其吸光值A(chǔ)0,實驗重復(fù)3次,以平均值作為測定結(jié)果,采用不同濃度梯度的VC作為陽性對照組按照同法進行測試[16]。依據(jù)公式計算不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率,公式為:

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上數(shù)據(jù)均為各待測溶液做3個平行,每平行測3次求平均值所得結(jié)果。實驗數(shù)據(jù)采用了Excel 2003、SPSS 22.0、Design-Expert 8.0.5軟件進行了統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溫度的影響 提取溫度對黃花油點草總黃酮得率的影響如圖1所示。由此可知,總黃酮得率隨溫度變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當(dāng)溫度達45 ℃,總黃酮得率達最大值。原因可能是隨著提取溫度不斷升高,黃花油點草中黃酮類物質(zhì)的溶出度增加;但當(dāng)溫度過高時則會破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu),降低了黃花油點草總黃酮的得率[17]。因此,黃花油點草總黃酮的提取最佳溫度為45 ℃。

圖1 超聲提取溫度對黃花油點草總黃酮得率的影響

2.1.2 提取時間的影響 提取時間對黃花油點草總黃酮得率的影響如圖2所示。由此可知,隨提取時間的延長總黃酮得率先增加后降低,并在60 min時達最高值。這是在超聲波作用下,隨時間增加,提取液中總黃酮物質(zhì)析出也不斷增多,但過長時間的超聲波處理則使部分黃酮結(jié)構(gòu)被破壞或和其他物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致黃花油點草總黃酮得率下降[17]。因此較適宜的提取時間為60 min。

圖2 超聲提取時間對黃花油點草總黃酮得率的影響

2.1.3 超聲功率的影響 超聲功率對黃花油點草總黃酮得率的影響如圖3所示。由此可知,隨超聲功率的增大總黃酮得率先增加后稍有下降。這是由于超聲波的機械力會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使黃花油點草中的黃酮類物質(zhì)析出。但超聲功率過大時,破壞了部分黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu),致使黃花油點草總黃酮得率略有下降[18]。因超聲功率在210～270 W范圍內(nèi),總黃酮得率變化不大,出于成本考慮,選取210 W作為較佳的超聲提取功率。

圖3 超聲功率對黃花油點草總黃酮得率的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃花油點草總黃酮得率的影響如圖4所示。由此可知,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,總黃酮得率呈現(xiàn)出先增加后持續(xù)下降的趨勢,并當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時,總黃酮得率達最大值。這可能是由于乙醇濃度較低和較高時,溶劑的極性過大或過小,導(dǎo)致總黃酮的溶解度降低[18],總黃酮得率下降。因此,黃花油點草總黃酮提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時提取效果最佳。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃花油點草總黃酮得率的影響

2.1.5 料液比的影響 料液比對黃花油點草總黃酮得率的影響如圖5所示。由此可知,在其它條件不變的情況下,隨提取溶劑量的增大,總黃酮得率呈現(xiàn)先增加后不變的趨勢,當(dāng)料液比達1∶40 (g/mL)時,總黃酮得率不再上升,表明料液比為1∶40 (g/mL)時,供試樣品中的總黃酮絕大部分已被提取出,總黃酮含量不再隨提取溶劑量的增大而增加,因此,料液比選擇1∶40 (g/mL)較宜。

圖5 料液比對黃花油點草總黃酮得率的影響

2.1.6 提取次數(shù)的影響 提取次數(shù)對黃花油點草中總黃酮得率的影響如圖6所示。由此可知,增加次數(shù)的情況下,1次提取與2次提取總黃酮得率相差0.903 mg/g,只提高了7.333%,含量增加并不大,出于節(jié)約成本考慮,選擇提取次數(shù)為1次。

圖6 提取次數(shù)對黃花油點草總黃酮得率的影響

由以上單因素考察結(jié)果可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時,總黃酮得率最高,說明在此條件下樣品中黃酮類物質(zhì)的溶解度最大,此時考察其他因素對總黃酮得率影響時更具有可信度;提取次數(shù)為1次時,與2次差異不大。因此,本實驗在50%乙醇為提取溶劑,提取1次的固定條件下,以料液比、提取時間、提取溫度、超聲功率四個因素為影響因子,黃花油點草總黃酮得率為響應(yīng)值,進行黃花油點草總黃酮提取工藝的響應(yīng)面實驗分析。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型建立與分析 利用軟件Design Expert 8.0.5的Box-Behnken中心組合設(shè)計,對料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、超聲功率(D)進行響應(yīng)面實驗,實驗結(jié)果見表2。對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析,得二次多項式回歸方程:

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

總黃酮得率=12.92+0.29A-0.074B+0.092C-0.33D+0.20AB+0.082AC+0.39AD+0.32BC+0.15BD-0.27CD-0.21A2-0.36B2-0.54C2-0.33D2

表3 回歸方程各項的方差分析

結(jié)果表明,模型中因素一次項A和D,交互項AD,二次項B2、C2和D2對黃花油點草總黃酮得率有非常顯著的影響(p<0.001),交互相BC和CD,二次項A2項對實驗的結(jié)果有極顯著影響(p<0.01),交互項AB對實驗結(jié)果有顯著影響(p<0.05),各因素對黃花油點草總黃酮得率影響的大小依次為D(超聲功率)>A(料液比)>C(提取溫度)>B(提取時間)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面坡度越陡峭,說明響應(yīng)值對于該因素的改變越敏感,而曲面坡度越平滑,該因素的改變對響應(yīng)值的影響也就越小[18],各因子間的回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面圖見圖7,由圖可知,料液比(A)與超聲功率(D)兩個因素隨取值的變化,其效應(yīng)曲面線變化比較陡峭,表明這兩個因素對黃花油點草總黃酮的提取的交互影響作用非常顯著;提取時間(B)與提取溫度(C)、提取溫度(C)與超聲功率(D)變化時其效應(yīng)曲面線陡峭,說明這些因素對黃花油點草總黃酮的提取的交互影響作用極顯著;料液比(A)與提取時間(B)其效應(yīng)曲面變化較平緩,說明這兩個因素對黃花油點草總黃酮得率的交互影響顯著;料液比(A)與提取溫度(C)、提取時間(B)與超聲功率(D)變化時其效應(yīng)曲面線平緩,說明這兩對因素對黃花油點草總黃酮的提取的交互影響作用不顯著。以上圖形分析結(jié)果與表3中交互項p值的分析結(jié)果一致。

圖7 各因素交互作用對黃花油點草總黃酮得率的響應(yīng)面與等高線圖

2.2.3 最佳提取工藝驗證 通過回歸模型得出黃花油點草中總黃酮提取的最佳條件為:超聲提取溫度為46.2 ℃,超聲功率為202.8 W,提取時間為60.90 min,料液比為1∶42.7。在此條件下黃花油點草中總黃酮的得率為13.035 mg/g?？紤]到實際操作,將最佳工藝條件修正為超聲提取溫度45 ℃,超聲功率210 W、提取時間60 min、料液比1∶40 (g/mL)。稱取黃花油點草干燥粉3份,以此條件進行3次重復(fù)性實驗,實際測得黃花油點草總黃酮的提取得率為(12.966±0.045) mg/g,與模型預(yù)測值13.035 mg/g十分接近,兩者的RSD值為0.375%,由此說明此模型和方法的可行性和有效性較好。

2.3 抗氧化活性測定分析結(jié)果

2.3.1 對羥自由基(·OH)的清除率測定 黃花油點草不同溶劑提取物和VC對羥自由基(·OH)的清除率結(jié)果如圖8、圖9。

圖8 黃花油點草不同溶劑提取物對羥自由基(·OH)的清除能力

圖9 不同濃度VC對羥自由基(·OH)的清除能力

由圖8、圖9可知,不同極性提取物對羥自由基(·OH)表現(xiàn)出的清除能力強弱不一,但其都低于VC對羥自由基(·OH)的清除能力。其中50%乙醇、水、甲醇提取物對羥自由基(·OH)的IC50值依次為2.135、3.249、4.404 mg/mL,當(dāng)樣品濃度在0～4 mg/mL時,樣品之間對羥自由基的清除能力相差較小;當(dāng)濃度范圍為4～16 mg/mL時,隨著濃度的增加,各樣品之間的清除羥自由基能力的差距逐漸變大,且50%乙醇始終高于水提取物和甲醇提取物;當(dāng)濃度范圍為16～20 mg/mL時,50%乙醇提取物清除羥自由基的能力達最大值,最大清除率為98%。

2.3.2 2,2-二苯基-1-苦苯肼(DPPH)清除率的測定 黃花油點草不同溶劑提取物和VC對DPPH自由基的清除率見圖10、圖11。

圖10 黃花油點草不同溶劑提取物對DPPH的清除能力

圖11 不同濃度VC對DPPH的清除能力

由圖10、圖11可知,不同溶劑提取物對DPPH自由基表現(xiàn)出的清除能力強弱不一,但都低于VC對DPPH自由基的清除能力。提取物對DPPH的清除率隨濃度的變化而變化,當(dāng)提取物的濃度小于6 mg/mL時,對DPPH的清除能力大小依次為50%乙醇、甲醇、水提取物;當(dāng)提取物濃度大于6 mg/mL時,提取物對DPPH的清除率大小依次為甲醇、水、50%乙醇提取物,且甲醇提取物清除率達最大,為75%。以0～6 mg/mL濃度范圍做線性回歸方程,50%乙醇、甲醇、水提取物對DPPH的IC50值依次為3.480、3.670、3.780 mg/mL。

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到黃花油點草總黃酮的超聲輔助提取最優(yōu)工藝條件:提取溫度45 ℃、超聲功率210 W、料液比1∶40 (g/mL)、提取時間60 min、乙醇濃度50%、提取次數(shù)1次,在此條件下黃花油點草總黃酮的提取得率為(12.966±0.045) mg/g,與模型預(yù)測值13.035 mg/g高度相符。該方法可為黃花油點草總黃酮研究提供科學(xué)參考。

本實驗選取常見抗氧化性評價方法DPPH法和鄰氮二菲法對黃花油點草的水提取物、乙醇提取物、甲醇提取物的抗氧化性進行化學(xué)評價。結(jié)果表明,黃花油點草不同溶劑提取物的抗氧化能力存在差異,且濃度與抗氧化能力存在正相關(guān),既濃度越高其抗氧化性越強,其中黃花油點草的50%乙醇提取物的抗氧化能力>甲醇提取物>水提取物,而通過對相同濃度梯度的提取物的清除率及總黃酮得率對比可知,黃花油點草的抗氧化能力與總黃酮含量成正相關(guān),既總黃酮含量越高者其抗氧化能力越高,但黃花油點草各提取物的抗氧化能力均低于VC。因此,黃花油點草各提取物具有一定抗氧化活性。

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