巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合釀酒酵母發(fā)酵改善沙棘果酒風(fēng)味

朱明明,何鴻舉,*,樊明濤,冉軍艦,馬漢軍

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)是屬薔薇目胡頹子科沙棘屬的落葉灌木,主要分布于中國西北部,尤其是青海省[1]。沙棘果是其成熟果實(shí),也稱為醋柳棗和沙棗。近年來,由于沙棘果富含油脂、維生素C、蛋白質(zhì)(球蛋白和白蛋白)、類胡蘿卜素、飽和及不飽和脂肪酸、游離氨基酸、多酚和維生素E等[2-3]而受到廣泛關(guān)注。因而很多文獻(xiàn)報(bào)道了沙棘果的藥理學(xué)作用,包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗應(yīng)力、護(hù)肝、防輻射和修復(fù)組織等[4-5]。但是,沙棘果儲(chǔ)存期很短,而且受到物理損傷或微生物污染而腐敗[6]。因此,研究沙棘果的采后加工具有重要的實(shí)際意義。

目前沙棘果的加工產(chǎn)品主要有沙棘果汁和沙棘果酒,其中沙棘果酒較沙棘果汁的加工而言,無需高溫處理,可保留大部分的香氣物質(zhì)而備受加工工廠的青睞[7-8]。沙棘果酒最大的問題是香味寡淡。類胡蘿卜素是一類重要的香味前體物質(zhì),可衍生成具有較低香氣閾值的香氣物質(zhì),是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的重要指標(biāo),尤其是降異戊二烯類物質(zhì),如β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等,可有效改善沙棘果酒香味不足的問題[9]。沙棘果汁中類胡蘿卜素的含量可達(dá)4.075 mg/L[10-11],而沙棘果酒釀造過程中,由類胡蘿卜素自發(fā)降解產(chǎn)生的香氣物質(zhì)類型及含量都非常少。因此如何有效地利用其中的類胡蘿卜素降解產(chǎn)香,并達(dá)到改善沙棘果酒風(fēng)味的目的是目前果酒釀造中的一項(xiàng)重要研究內(nèi)容。

課題組在前期實(shí)驗(yàn)中,首次在沙棘酒前期發(fā)酵過程中分離得到一株可高效催化類胡蘿卜素降解的菌株TS-82,經(jīng)鑒定為巴氏葡萄球菌(GenBank Accession No. KP171185)[12],無致病性,結(jié)果表明其不具備致病性,可安全用于食品生產(chǎn)中[13-14],并優(yōu)化其培養(yǎng)條件[15-17],對(duì)其所產(chǎn)類胡蘿卜素降解酶進(jìn)行分離純化及其酶學(xué)特性[13,18-20]和催化類胡蘿卜素降解的作用機(jī)理研究[21-23]。然而,還未見到巴氏葡萄球菌TS-82應(yīng)用于沙棘果酒釀造的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用巴氏葡萄球菌TS-82和釀酒酵母聯(lián)合發(fā)酵沙棘果酒,利用巴氏葡萄球菌TS-82可產(chǎn)類胡蘿卜素降解酶的特性改善沙棘果酒風(fēng)味,與傳統(tǒng)釀造的沙棘果酒比較香氣物質(zhì)種類和含量的變化,并研究了類胡蘿卜素和多酚類等營養(yǎng)物質(zhì)種類和含量的差異,以期改善傳統(tǒng)釀造工藝,研制出香醇可口、營養(yǎng)豐富、適于消費(fèi)者飲用的新型沙棘果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏葡萄球菌菌株TS-82 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品發(fā)酵與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保存;酵母菌種EXCE-SP 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品發(fā)酵與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;沙棘汁 采自青海的沙棘果(中國沙棘)新鮮壓榨而成;β-胡蘿卜素、、β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品 購自Sigma-Aldrich;色譜級(jí)甲醇 購自美國Tedia;色譜級(jí)乙酸 購自天津科密歐;色譜級(jí)水 購自杭州娃哈哈;其他分析純?cè)噭?均購自天津科密歐。

LC-20A型高效液相色譜儀 島津(日本)公司;UV-2000型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;GC-MS Trace Dsq GC-MS-Finnigan(美國)公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、手動(dòng)SPME進(jìn)樣器 Supelco(美國)公司;DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) Agilent(美國)公司;cp2245型分析天平 Sartorius(德國)公司;HH恒溫水浴鍋 科偉永興(北京)儀器有限公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱 ?，?上海)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 博訊實(shí)業(yè)(上海)有限公司;R-120型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 BüCHI(瑞士)公司;低溫離心機(jī) 中科中佳(安徽)科學(xué)儀器有限公司;pH計(jì) 精密科學(xué)儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巴氏葡萄球菌TS-82培養(yǎng)液的制備 改良查氏液體培養(yǎng)基:K2HPO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,KCl 0.5 g/L,NaNO33 g/L,蔗糖30 g/L,番茄汁20 g/L,酵母浸粉3 g/L。121 ℃下滅菌20 min后備用。將TS-82菌株接種于上述滅菌培養(yǎng)基中,在37 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長末期,于4 ℃冰箱待用。

1.2.2 釀酒酵母培養(yǎng)液的制備 YPD液體培養(yǎng)基:蛋白胨:20 g/L,酵母膏:10 g/L,葡萄糖:20 g/L。121 ℃下滅菌20 min后備用。將酵母菌菌落接種于YPD滅菌培養(yǎng)基中,在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h,制備酵母培養(yǎng)液,于4 ℃冰箱待用。

1.2.3 沙棘果酒的釀造工藝 在實(shí)驗(yàn)過程中釀造兩種不同類型的沙棘果酒:釀酒酵母發(fā)酵沙棘果酒,釀酒酵母和巴氏葡萄球菌聯(lián)合發(fā)酵沙棘果酒。

1.2.4 類胡蘿卜素含量的測定 采用皂化法[24]提取類胡蘿卜素。具體操作如下:取20 mL沙棘果汁或果酒,加入固體NaOH至溶液飽和,均勻攪拌,在90 ℃水浴鍋中恒溫皂化30 min后,取出迅速冷卻至室溫,將pH調(diào)至3.0,加入乙酸乙酯(20 mL/次)多次萃取,直至有機(jī)相無色,將所有有機(jī)相合并、濃縮得類胡蘿卜素提取液,利用無水硫酸鈉避光處理1 h,除去有機(jī)相中的水分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用丙酮定容至10 mL,在460 nm下測定其吸光度值,計(jì)算含量。

類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以β-胡蘿卜素為標(biāo)準(zhǔn)品,用丙酮溶解,濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L。以丙酮作為空白,在460 nm下測定其吸光度值,用所得數(shù)據(jù)作圖可得到β-胡蘿卜素濃度與吸光度值的線性關(guān)系。β-胡蘿卜素濃度與吸光度值的線性關(guān)系式:y=0.0844x+0.0653(R2=0.991),其中x為β-胡蘿卜素濃度,y為460 nm下的吸光度值。

1.2.5 十種多酚含量的變化 取10 mL酒樣,用NaOH(1.0 mol/L)調(diào)節(jié)pH至7.0左右,加入乙酸乙酯(20 mL/次)萃取三次,混合上清,剩余溶液利用HCl調(diào)pH至2.0,加入乙酸乙酯(20 mL/次)萃取三次,混合上清,4 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),殘?jiān)苡?0 mL甲醇中,4 ℃避光待用。采用高效液相色譜法[25]分析十種多酚含量的變化。色譜柱:C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,)。流動(dòng)相A:1%乙酸水溶液,流動(dòng)相B:甲醇,梯度洗脫,時(shí)間程序:0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%～50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70%～5% B。柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL,二極管陣列檢測器檢測,檢測波長:280 nm。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和測定:分別精確稱取十種多酚標(biāo)準(zhǔn)品,溶于10 mL甲醇中作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將不同標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋不同濃度,采用上述HPLC方法測定各個(gè)多酚標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。混標(biāo)則是將所有標(biāo)準(zhǔn)品混合,使各標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為1.0 mg/mL,采用上述條件測定混標(biāo)曲線。

1.2.6 香氣物質(zhì)種類和含量的變化 參考Wang等[8]的頂空-固相微萃取方法(HS-SPME)萃取沙棘果酒中的揮發(fā)性成分。吸附完全后將萃取頭拔出并迅速插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中,250 ℃熱解析處理5 min。柱溫箱升溫程序如下:40 ℃,5 min;5 ℃/min升溫至200 ℃;10 ℃/min升溫至240 ℃;240 ℃,5 min。傳輸線230 ℃;離子源250 ℃;電離方式EI,離子能量70 eV;發(fā)射電流100 μA,檢測電壓1.4 kV;質(zhì)量掃描范圍:35～400 m/z。

香氣標(biāo)準(zhǔn)品的配制及測定:采用無水乙醇分別將3-辛醇內(nèi)標(biāo)和β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至濃度為134、187、189 mg/L。隨后各取三種化合物4 μL混合均勻,溶解于10 mL的6%乙醇溶液中,HS-SPME法萃取揮發(fā)性物質(zhì)并利用GC-MS進(jìn)行解析,從而計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)化合物β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅蘭酮與內(nèi)標(biāo)間的響應(yīng)因子,其響應(yīng)因子為(標(biāo)準(zhǔn)品濃度/標(biāo)準(zhǔn)品峰面積)/(內(nèi)標(biāo)濃度/內(nèi)標(biāo)峰面積)[12]。

定性及定量分析:利用隨機(jī)Xcalibur工作站的標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù),并利用已有標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)機(jī)檢結(jié)果進(jìn)行確認(rèn),最終確定香氣成分;根據(jù)所得響應(yīng)因子計(jì)算香氣化合物濃度,參考Hua等[26]的方法確立其計(jì)算公式為:香氣化合物濃度=(香氣物質(zhì)峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積)×內(nèi)標(biāo)濃度×響應(yīng)因子。而對(duì)于沒有對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的香氣物質(zhì)采用結(jié)構(gòu)相似的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行計(jì)算[27]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上所有實(shí)驗(yàn)均為三次平行,取平均值。使用DPS軟件(Version Rel.6.55,1997)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

沙棘果汁初始pH3.5,總糖為16%,滴定酸含量3.35 g/L;按照GB/T 4789.25-2003測定了金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌,無致病菌檢出;經(jīng)傳統(tǒng)釀造和巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵后所得沙棘酒的pH在2.8～2.9范圍內(nèi),殘?zhí)橇慷荚?.5 g/L左右,酒精度也都達(dá)到6%vol,無致病菌,表明加入巴氏葡萄球菌TS-82可使沙棘果酒與傳統(tǒng)釀造的產(chǎn)品相一致,達(dá)到干酒的要求(殘?zhí)橇康陀? g/L)。

2.1 聯(lián)合發(fā)酵對(duì)釀造過程中類胡蘿卜素含量的影響

利用皂化法測定傳統(tǒng)釀造方法和巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵對(duì)沙棘果酒釀造過程中類胡蘿卜素含量的影響,其變化結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,在沙棘果酒的主發(fā)酵過程中,類胡蘿卜素的含量都呈現(xiàn)出不同的下降趨勢,分析原因可能是類胡蘿卜素比較敏感,見光或遇熱都易降解。而在主發(fā)酵過程中添加巴氏葡萄球菌TS-82后,類胡蘿卜素含量與傳統(tǒng)方法相比有明顯的降低,主要是由于該菌可產(chǎn)生大量的胞外類胡蘿卜素降解酶,此酶比較適合酸性環(huán)境,耐酸性較好[18-19,21],在沙棘果酒的釀造過程中依然具有催化活性。在發(fā)酵后期,類胡蘿卜素含量變化較小,這是由于TS-82進(jìn)入衰亡期,而且前期所產(chǎn)的類胡蘿卜素降解酶的活性逐漸喪失而造成的。因此巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵既可催化部分類胡蘿卜素降解,又可保留一定量的類胡蘿卜素。

圖1 兩種沙棘果酒釀造過程中類胡蘿卜素含量的變化

2.2 聯(lián)合發(fā)酵對(duì)釀造過程中多酚種類和含量的影響

2.2.1 多酚混標(biāo)分離及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)沙棘果酒中主要存在沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸和槲皮素十種多酚,因此在實(shí)驗(yàn)過程中選擇這十種多酚標(biāo)準(zhǔn)品檢測沙棘果酒中多酚含量的變化。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的十種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的波長數(shù)據(jù),選用280 nm進(jìn)行多酚檢測,得到混標(biāo)的液相色譜圖如圖2所示。沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸和槲皮素的保留時(shí)間分別是3.898,5.372,9.218,12.927,15.474,18.623,24.104,27.871,29.351、35.139 min。

圖2 十種多酚標(biāo)準(zhǔn)品在280 nm下的液相色譜圖

采用外標(biāo)法對(duì)上述十種多酚標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行線性回歸分析。利用相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和對(duì)應(yīng)的濃度關(guān)系進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用七種不同的濃度梯度按上述方法進(jìn)行分析,每個(gè)濃度做三次平行,取平均值。標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 十種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 不同釀造方法多酚含量的變化 從經(jīng)過低溫澄清、過濾后的沙棘果酒成品中提取多酚。對(duì)經(jīng)聯(lián)合發(fā)酵和傳統(tǒng)發(fā)酵的樣品中的多酚進(jìn)行定性分析,結(jié)果如圖3、圖4所示,可知經(jīng)聯(lián)合發(fā)酵的樣品中的多酚種類與傳統(tǒng)方法釀造所得樣品中的多酚種類相同。

圖3 1#沙棘果酒在280 nm下的液相色譜圖

圖4 2#沙棘果酒在280 nm下的液相色譜圖

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析,計(jì)算含量,比較其多酚含量的變化,結(jié)果如表2所示。由表2可知,聯(lián)合發(fā)酵釀造的沙棘果酒中沒食子酸、兒茶酸、阿魏酸、金絲桃苷和鞣花酸的含量顯著增加(p<0.05),總酚含量達(dá)到9.807 mg/mL,較傳統(tǒng)釀造的沙棘果酒(8.171 mg/mL)有明顯提高(p<0.05)。

表2 不同沙棘果酒中十種多酚的含量(mg/mL)

2.3 聯(lián)合發(fā)酵對(duì)釀造過程中降異戊二烯類香味物質(zhì)含量的影響

經(jīng)GC-MS測定,巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵后所得沙棘果酒成品中的降異戊二烯類物質(zhì)如圖5所示,圖6表示傳統(tǒng)釀造所得沙棘果酒中的揮發(fā)性成分。由圖5和6可知,經(jīng)類胡蘿卜素降解生成的香味物質(zhì)主要有β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮-5,6-環(huán)氧化物和二氫獼猴桃內(nèi)酯。經(jīng)兩種釀造方法所得香味物質(zhì)含量的比較如表3所示。

圖5 巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵得沙棘果酒中降異戊二烯類物質(zhì)的GC-MS分析

圖6 酵母菌發(fā)酵得沙棘果酒中降異戊二烯類物質(zhì)的GC-MS分析

眾所周知,類胡蘿卜素降解衍生的降異戊二烯類物質(zhì),如β-紫羅蘭酮(有類似紫羅蘭香氣,具有果實(shí)底韻)[28]和β-大馬酮(具近似玫瑰的強(qiáng)烈芳香)[12],由于其極低的香氣閾值,成為評(píng)價(jià)酒的重要指標(biāo)[9]。由表3結(jié)果可知,經(jīng)巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵可顯著促進(jìn)沙棘果酒中降異戊二烯類化合物的含量(p<0.05)。其中β-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮-5,6-環(huán)氧化物含量增加最多,分別達(dá)到0.16和0.11 mg/mL,這與之前課題組得到的TS-82所產(chǎn)酶催化β-胡蘿卜素降解所產(chǎn)的香氣物質(zhì)相一致[21],表明巴氏葡萄球菌TS-82在沙棘果酒釀造過程中產(chǎn)生類胡蘿卜素降解酶,可有效改善沙棘果酒的風(fēng)味。

表3 不同沙棘果酒中主要異戊二烯類香氣物質(zhì)的含量(mg/mL)

3 結(jié)論

利用巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合釀酒酵母發(fā)酵沙棘果酒可催化部分類胡蘿卜素降解產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì),同時(shí)也可保留一定量的類胡蘿卜素,確保沙棘果酒的營養(yǎng)和風(fēng)味兼得。同樣地,GC-MS結(jié)果也表明聯(lián)合發(fā)酵的方法可有效改善沙棘果酒的風(fēng)味。而在實(shí)驗(yàn)過程中,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和巴氏葡萄球菌TS-82的共同添加也可提高沙棘果酒中游離酚的含量。綜上,利用巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母的發(fā)酵方法,可使沙棘果酒的風(fēng)味得到明顯改善。

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