耙齒菌EA-LJS-73產(chǎn)七葉皂苷培養(yǎng)基配方的響應(yīng)面法優(yōu)化

劉軍生,羅陽蘭,解修超,*,鄧百萬,王 嬌,楊玉梅

(1.陜西理工大學(xué)陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西漢中 723001;2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中723001;3.略陽縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心,陜西漢中 724300)

七葉皂苷具有顯著的抗腫瘤[1]、抗病毒[2]、抗炎消滲[3]、抑制胃酸分泌[4],恢復(fù)毛細(xì)血管通透性[5],提高靜脈張力[6],改善血液循環(huán)[7-8],促進(jìn)腦細(xì)胞恢復(fù)[9-10]、清除氧自由基[11]等作用[12]?；趯ζ呷~樹皂苷藥理作用的認(rèn)識不斷加深,對七葉皂苷的需求也日益增加。而目前國內(nèi)七葉皂苷主要來自于七葉樹及其果實娑羅子[13],七葉樹雖分布廣泛,但種群較小,總體資源儲量遠(yuǎn)不及人們對其醫(yī)藥的需求[14],且不同產(chǎn)地的娑羅子品質(zhì)不一[15],同時用娑羅子提取七葉皂苷生產(chǎn)成本高、污染大、生產(chǎn)周期受限等問題較為突出,導(dǎo)致七葉皂苷相關(guān)藥品價格居高不下。

本文對已分離出一株具有產(chǎn)七葉皂苷活性的內(nèi)生真菌耙齒菌EA-LJS-73,采用Box-Behnken 設(shè)計分析確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方并通過發(fā)酵動力學(xué)實驗進(jìn)行驗證，以研究發(fā)酵過程中菌株的生長速率、培養(yǎng)基的消耗速率和七葉皂形成速率的相互作用和隨時間變化的規(guī)律,采用HPLC檢測培養(yǎng)基優(yōu)化前后發(fā)酵液中七葉皂苷的含量變化進(jìn)行對比。以期通過本研究為后期七葉皂苷的生產(chǎn)提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

耙齒菌EA-LJS-73(Irpexsp.) 由陜西理工大學(xué)陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心分離并保藏,菌絲白色,氣生菌絲發(fā)達(dá),生長后期有大量黃色分泌物,菌絲系統(tǒng)為二體型,生殖菌絲透明具簡單隔膜,直徑3～4 μm,具鎖狀聯(lián)合,營養(yǎng)菌絲壁厚,直徑1～3 μm，囊狀體顯著8 μm×15 μm,棒狀壁厚，結(jié)晶體近方形(10～20) μm×(8～12) μm；液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1 L):葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,MgSO45 g,起始pH7.0；滅菌條件為:103.4 kPa(1.05 kg/cm2)蒸汽壓下,溫度121 ℃,持續(xù)滅菌25 min；七葉皂苷標(biāo)品 純度>95%,購自上海生工;甲醇、磷酸、乙腈 均為國產(chǎn)色譜純;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

EYELA N100 O型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司;SW-CJ-1D型單人超凈工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司;YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV2550型紫外分光光度計 日本島津公司;HP1100型HPLC儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 耙齒菌EA-LJS-73發(fā)酵條件 溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min,250 mL三角瓶中裝液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基150 mL,接入種子液,接種量為2%,發(fā)酵時間7 d。

1.2.2 菌絲體生物量的測定 將發(fā)酵完成后的菌絲體過濾后用無菌水沖洗三遍,置于烘箱中40 ℃烘干至恒重,稱重。

1.2.3 七葉皂苷定量測定

1.2.3.1 發(fā)酵液的處理 將菌株EA-LJS-73接入液體搖瓶中,振蕩發(fā)酵7 d,超聲處理(功率為160 W,頻率為40 kHz)30 min,抽濾,收集發(fā)酵液用乙酸乙酯充分萃取發(fā)酵液,收集下層水相再用正丁醇萃取,收集正丁醇層,重復(fù)兩次,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱,依次用水、30%乙醇、70%乙醇進(jìn)行梯度洗脫,收集70%乙醇流分[16],低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加色譜級甲醇定容至100 mL,配制成提取物儲備液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 樣品顯色液制備 香草醛-冰醋酸-高氯酸法[17]:取樣品溶液1 mL,置于具塞試管中,50 ℃水浴加熱,揮干甲醇后加入5%香草醛-無水冰醋酸溶液0.2 mL,70%高氯酸0.8 mL,搖勻,70 ℃水浴加熱15 min,取出后用冷水終止反應(yīng)10 min,加9 mL無水甲醇稀釋,混勻后備用。

1.2.3.3 全波長掃描和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取七葉皂苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用無水甲醇定容至10 mL,配制1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,取1 mL于10 mL具塞試管中,按1.2.3.2方法處理溶液后,在500～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。

分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞試管中,按1.2.3.2方法處理,混勻后在551 nm處測定吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

單因素實驗：以0.2%的蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源,培養(yǎng)7 d后,抽濾,60 ℃烘干至恒重,稱取菌絲體干重為生物量,考察不同碳源對七葉皂苷濃度影響。

以0.2%的淀粉為碳源,以0.2%的酵母浸粉、硫酸銨、尿素和硝酸鉀分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨作為氮源,考察不同氮源對七葉皂苷濃度的影響。

以0.2%的淀粉為碳源,0.2%的酵母浸粉為氮源,以0.5%的氯化鉀、硫酸錳、氯化鈣和0.05%的硫酸亞鐵分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的MgSO4,考察不同無機(jī)鹽對七葉皂苷濃度的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理[18],選取淀粉(A)、酵母浸粉(B)、MgSO4(C)為變量,以七葉皂苷濃度為響應(yīng)值,每個變量按低、中、高3個水平分別以-1、0、+1進(jìn)行編碼[19]。

實驗因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平

1.2.6 HPLC驗證優(yōu)化前后七葉皂苷濃度 HPLC檢測條件:色譜柱C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),紫外檢測波長220 nm,流動相為乙腈∶0.2%磷酸(體積比為37∶63),進(jìn)樣量20 μL,流動相流速為1 mL/min,柱溫25 ℃[20]。

1.2.7 菌株EA-LJS-73的發(fā)酵動力學(xué)分析實驗 把菌株EA-LJS-73接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),每隔24 h取樣檢測其各項發(fā)酵參數(shù)如生物量和七葉皂苷濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 七葉皂苷定量測定

2.1.1 全波長掃描 通過香草醛-冰醋酸-高氯酸法,七葉皂苷標(biāo)準(zhǔn)品顯色后全波長掃描結(jié)果見圖1,七葉皂苷標(biāo)準(zhǔn)品在紫外最大吸收波長為551 nm。

圖1 七葉皂苷標(biāo)準(zhǔn)品全波長掃描圖

2.1.2 七葉皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線 以七葉皂苷濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=7.9681X+0.8845,R2=0.9955,將不同樣品的OD值代入方程計算樣品所含七葉皂苷濃度。

2.2 單因素實驗

2.2.1 碳源的影響 由圖2可知,菌株EA-LJS-73能利用不同碳源生產(chǎn)七葉皂苷,尤其是以淀粉作為碳源時,每升發(fā)酵液中生物量能達(dá)到10.351 g,七葉皂苷濃度為0.946 g/L,且菌絲球緊密,發(fā)酵液粘稠度高,其次是葡萄糖>乳糖>麥芽糖>蔗糖。這是由于菌株EA-LJS-73在受到不同底物的刺激后所表達(dá)的基因不同或是基因表達(dá)量不同導(dǎo)致產(chǎn)量不同,在以淀粉為碳源時,菌株EA-LJS-73的生物量和七葉皂苷濃度達(dá)到最大。

圖2 碳源對菌株EA-LJS-73的影響

2.2.2 氮源的影響 由圖3可見,菌株EA-LJS-73能利用不同氮源產(chǎn)生七葉皂苷,其中酵母浸粉為氮源時生物量最大,達(dá)到10.635 g,七葉皂苷濃度也達(dá)到峰值0.968 g/L,其次是蛋白胨>尿素>硫酸銨>硝酸鉀。氮源主要用于菌體細(xì)胞器(細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)和含氮代謝物的合成,合適的氮源可促進(jìn)菌體生長及代謝產(chǎn)物的生成。

圖3 氮源對菌株EA-LJS-73的影響

2.2.3 無機(jī)鹽的影響 由圖4可見,在供試無機(jī)鹽中添加硫酸鎂時,菌絲球長速最快,生物量最大,為9.036 g,七葉皂苷濃度也達(dá)到峰值0.819 g/L,其次是硫酸錳>氯化鈣>氯化鉀>硫酸亞鐵。硫酸鎂在菌體生長過程中提供大量鎂離子,而鎂離子是許多酶的重要組成部分,因此菌絲生長快速,次生代謝產(chǎn)物合成較快。

圖4 無機(jī)鹽對菌株EA-LJS-73的影響

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.3.1 實驗設(shè)計方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出的實驗方案及實驗結(jié)果如表2所示,以七葉皂苷濃度為響應(yīng)值(Y),以淀粉(A)、酵母浸粉(B)、MgSO4(C)為自變量,建立三因素三水平中心組合實驗設(shè)計共包括15個實驗方案,其中有3個中心實驗點,用以計算實驗誤差。

表2 響應(yīng)面分析實驗方案及結(jié)果

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析,分析結(jié)果見表3,對各因素回歸擬合后,得到二次回歸方程如下:

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果

Y=1.03-0.039A-0.15B+0.27C-0.070AB-0.11AC-0.057BC-0.13A2-0.15B2-0.44C2

2.3.3 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)回歸方程繪制七葉皂苷濃度隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖[21]。由響應(yīng)曲面圖可知淀粉、酵母浸粉、MgSO4這3個因素對七葉皂苷濃度的影響(圖5～圖7)。每個響應(yīng)曲面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用,另一個因素保持在編碼水平的0水平[22]。

圖5結(jié)果顯示,淀粉和酵母浸粉的交互作用顯著。在淀粉質(zhì)量一定條件下,隨著酵母浸粉質(zhì)量的增加,七葉皂苷的濃度會緩慢升高至平穩(wěn),然后迅速下降。在酵母浸粉質(zhì)量一定的條件下,隨著淀粉質(zhì)量的增加,七葉皂苷濃度會迅速升高至平穩(wěn),然后略有下降。

圖5 Y=f(AB)響應(yīng)面和等高線

圖6結(jié)果顯示,淀粉質(zhì)量和無機(jī)鹽質(zhì)量的交互作用極顯著。在低淀粉質(zhì)量條件下隨著無機(jī)鹽質(zhì)量的增加,七葉皂苷濃度會緩慢升高至平穩(wěn),然后略有下降;在高淀粉質(zhì)量條件下,隨著無機(jī)鹽質(zhì)量的增大,七葉皂苷濃度會迅速升高,最后趨于平穩(wěn)。無機(jī)鹽質(zhì)量較低條件下,隨著淀粉質(zhì)量的增大,七葉皂苷濃度緩慢升高至平穩(wěn),然后迅速下降;在無機(jī)鹽質(zhì)量較高條件下,隨著淀粉質(zhì)量的增大,七葉皂苷濃度迅速升高至平穩(wěn),然后下降。

圖6 Y=f(AC)響應(yīng)面和等高線

圖7結(jié)果顯示,酵母浸粉質(zhì)量和無機(jī)鹽質(zhì)量的交互作用顯著。在低酵母浸粉質(zhì)量條件下隨著無機(jī)鹽質(zhì)量的增加,七葉皂苷濃度會緩慢升高至平穩(wěn),然后略有下降;在高酵母浸粉質(zhì)量條件下,隨著無機(jī)鹽質(zhì)量的增大,七葉皂苷濃度會迅速升高,最后趨于平穩(wěn)。無機(jī)鹽質(zhì)量較低條件下,隨著酵母浸粉質(zhì)量的增大,七葉皂苷濃度緩慢升高至平穩(wěn),然后迅速下降;在無機(jī)鹽質(zhì)量較高條件下,隨著酵母浸粉質(zhì)量的增大,七葉皂苷濃度迅速升高至平穩(wěn),然后下降。

圖7 Y=f(BC)響應(yīng)面和等高線

圖5～圖7直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響,由圖可知:淀粉和酵母浸粉的交互作用顯著，淀粉質(zhì)量和無機(jī)鹽質(zhì)量之間有極顯著的交互作用，酵母浸粉質(zhì)量和無機(jī)鹽質(zhì)量之間也有顯著交互作用。并且可得出A、B、C存在極值點,Y的最大估計值為1.116 g/L,對應(yīng)的因素濃度為淀粉22.660 g/L,酵母浸粉4.230 g/L,MgSO47.600 g/L,即為最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

為了驗證響應(yīng)面分析的可靠性,采用上述最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗證實驗,用菌株EA -LJS-73進(jìn)行3次平行,培養(yǎng)7 d后采用HPLC定量測定驗證,優(yōu)化后七葉皂苷濃度平均值為1.105 g/L,與優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比菌株產(chǎn)七葉皂苷的能力提高了35%。結(jié)果表明,經(jīng)過響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,證明用響應(yīng)面法可以有效的優(yōu)化培養(yǎng)基,促使七葉皂苷的產(chǎn)量得到了極大程度的提高,為發(fā)酵生產(chǎn)七葉皂苷奠定了基礎(chǔ)。

2.4 菌株EA-LJS-73的發(fā)酵動力學(xué)分析

從EA-LJS-73的發(fā)酵曲線(圖8)可以看出,七葉皂苷濃度和生物量的增長曲線基本一致,發(fā)酵培養(yǎng)2 d后進(jìn)入快速增長期,七葉皂苷濃度隨著生物量的增加而增加。發(fā)酵培養(yǎng)6 d后進(jìn)入穩(wěn)定生長期,七葉皂苷開始大量積累。在10 d時,生物量和七葉皂苷濃度達(dá)到最大值,分別為11.376 g(菌體干重)和1.665 g/L,此時為發(fā)酵終點。達(dá)到發(fā)酵終點以后,生物量和七葉皂苷濃度均開始下降,可能是因為淀粉將消耗盡,菌體自溶,七葉皂苷被當(dāng)做碳源被菌體利用。

圖8 菌株EA-LJS-73發(fā)酵曲線

3 結(jié)論

采用 Box-Behnken設(shè)計對產(chǎn)七葉皂苷菌株EA-LJS-73發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了七葉皂苷濃度回歸模型,由該模型優(yōu)化的發(fā)酵條件(1 L)為:淀粉22.660 g,酵母浸粉4.230 g,MgSO47.600 g,七葉皂苷濃度的理論值可達(dá)到1.116 g/L。在此條件下,通過驗證實驗測得最適培養(yǎng)基發(fā)酵生成的七葉皂苷濃度為1.105 g/L,菌株產(chǎn)七葉皂苷的能力提高了35%,與模型預(yù)測結(jié)果相近,進(jìn)一步驗證了模型的可靠性。之后對高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行動力學(xué)研究,得出在10 d時,菌體生物量和七葉皂苷濃度達(dá)到最高,此時達(dá)到發(fā)酵終點,生物量為11.376 g(菌體干重),而七葉皂苷濃度達(dá)到1.665 g/L,證明本實驗優(yōu)化的結(jié)果,具有實際意義。

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