煙曲霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

王昊鵬,吳黎明,趙柳微,倪 輝,肖安風(fēng),張中印,*

(1.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京 100093;3.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門 361021)

煙曲霉素(Fumagillin)是一種重要的生理活性物質(zhì),是由煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物并具有高效的抗菌、抗蟲和抗癌抗腫瘤作用。Hanson等[1]在1949年第一次從編號為H-3的曲霉菌株中分離得到煙曲霉素,在發(fā)現(xiàn)之初就被用作抗菌抗蟲藥物(抗阿米巴藥)[2]。Mccowen等[3]首次提到煙曲霉素對蜜蜂微孢子蟲病(ApisNosema)有預(yù)防作用,在美國、加拿大等養(yǎng)蜂發(fā)達(dá)國家,煙曲霉素已被用于治療蜜蜂微孢子蟲病,并獲得了良好的治療效果[4]。煙曲霉素是當(dāng)前治療蜜蜂微孢子蟲病的唯一有效藥物[5],也可用于治療魚類的小孢子蟲病[6-7];此外,煙曲霉素能夠顯著降低脂肪量改善由于飲食誘導(dǎo)的肥胖癥[8],有望成為減肥新藥物。同時煙曲霉素能夠抑制新生血管的生成[9],具有抑制腫瘤生長的作用[10-11]。煙曲霉素結(jié)構(gòu)復(fù)雜,性質(zhì)不穩(wěn)定,易發(fā)生熱降解和紫外降解[12-13],化學(xué)合成過程復(fù)雜[14],主要是通過微生物發(fā)酵獲得。由于知識產(chǎn)權(quán)和貿(mào)易保護(hù)等原因,目前國內(nèi)煙曲霉素發(fā)酵生產(chǎn)研究尚屬空白,尚未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

發(fā)酵優(yōu)化工藝是提高微生物發(fā)酵產(chǎn)量的有效方法。響應(yīng)面分析法(Response surface methodology,RSM)是優(yōu)化發(fā)酵工藝的一種高效方法,廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、生物工程、食品工業(yè)等領(lǐng)域[15-17]。

本研究以工業(yè)發(fā)酵常見碳、氮源為基礎(chǔ),通過單因素實驗及響應(yīng)面實驗對煙曲霉素的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,以提高煙曲霉素的發(fā)酵產(chǎn)量,為煙曲霉素產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙曲霉CEA-1701(AspergillusfumigatusCEA-1701) 中國農(nóng)科院蜜蜂研究所提供；煙曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品 北京百靈威科技有限公司;色譜純甲醇 美國Tedia公司;玉米粉 漳州閩成玉米制品有限公司;消泡劑 按照泡敵∶植物油∶水(V/V/V)=1∶1∶3配制,其中泡敵取自廈門匯盛生物有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

WFJ7200型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;REC5004V21型層析柜 賽默飛世爾科技(上海)公司;BS223S型電子分析天平 德國賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;pH計PE20實驗室 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LC-20AT型高效液相色譜儀和Inertsustain ? C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱 島津公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:土豆洗凈切絲,稱取200 g,使用電磁爐加水煮沸30 min,待冷卻后,過200目篩濾去濾渣,添加20 g葡萄糖,15 g瓊脂,定容至1000 mL,1×105Pa滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖30 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.013 g/L、K2HPO41.0 g/L、玉米粉2.0 g/L,初始pH為6.0±0.5,1×105Pa滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 初始發(fā)酵條件 裝液量為50 mL的250 mL錐形瓶,玻璃珠10顆,接種量為裝液量的1%,培養(yǎng)溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,培養(yǎng)周期144 h。

1.3.2 單孢子菌懸液的制備 將4 ℃貯藏的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)5～7 d得到成熟孢子。無菌操作下,用無菌生理鹽水洗下孢子,倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中,充分振蕩30 min。待孢子充分打散后,測菌懸液OD600值,并用無菌生理鹽水調(diào)整其OD600至2.0,即得單孢子菌懸液[18]。

1.3.3 接種及發(fā)酵 將制得的單孢子菌懸液于4 ℃層析柜中靜置,同步培養(yǎng)1 h后取出;待溫度升至室溫,以裝液量1%的接種量接種至裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)144 h。

1.3.4 最適碳源氮源的篩選

1.3.4.1 碳源篩選 保持搖瓶初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,并固定碳源含碳量為12.6 g/L,分別以蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、一水麥芽糖為單一碳源,每組3個平行,發(fā)酵培養(yǎng)144 h,取發(fā)酵液于5000 r/min離心10 min,測定發(fā)酵液中煙曲霉素含量。

1.3.4.2 氮源篩選 分別以酵母提取粉、尿素、胰蛋白胨、硝酸鈉、牛肉膏、硫酸銨為單一氮源,并固定各氮源的質(zhì)量濃度為3.0 g/L,其他物質(zhì)添加量同初始發(fā)酵培養(yǎng)基保持一致,每組3個平行,發(fā)酵培養(yǎng)144 h,取發(fā)酵液于5000 r/min離心10 min,測定發(fā)酵液中煙曲霉素含量。

1.3.5 單因素實驗

1.3.5.1 甘油濃度篩選 在上述碳源和氮源的基礎(chǔ)上,保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,在1.3.1所述的發(fā)酵條件下,考察0、10、20、30、40 g/L這5個不同甘油濃度對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響。

1.3.5.2 酵母提取粉濃度篩選 在以甘油30 g/L添加量時,保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,在1.3.1所述的發(fā)酵條件下,考察不同酵母提取粉濃度0、1、2、3、4、5 g/L對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響。

1.3.5.3 玉米粉濃度篩選 在以甘油30 g/L和酵母提取粉3 g/L添加量時,保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,在1.3.1所述的發(fā)酵條件下,考察不同玉米粉濃度0、1.5、2、2.5、3 g/L對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響。

1.3.5.4 鎂離子濃度篩選 在以甘油30 g/L、酵母提取粉3 g/L和玉米粉1.5 g/L添加量時,保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,在1.3.1所述的發(fā)酵條件下,考察不同MgSO4·7H2O濃度0、0.25、0.5、0.75、1 g/L對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響。

1.3.5.5 磷酸根離子濃度篩選 在以甘油30 g/L、酵母提取粉3 g/L、玉米粉1.5 g/L和MgSO4·7H2O 0.5 g/L添加量時,保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,在1.3.1所述的發(fā)酵條件下,考察不同K2HPO4濃度0、0.5、1、1.5、2 g/L對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響。

1.3.5.6 氯化鉀濃度篩選 在以甘油30 g/L、酵母提取粉3 g/L、玉米粉1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L和K2HPO40.5 g/L添加量時,保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,在1.3.1所述的發(fā)酵條件下,考察不同KCl濃度0、0.5、1、1.5、2 g/L對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響。

1.3.6 Plackett-Burman(PB)實驗設(shè)計 按照最適碳源、氮源配制培養(yǎng)基,根據(jù)單因素實驗結(jié)果,對甘油、酵母提取粉、玉米粉、MgSO4·7H2O、K2HPO4和KCl在內(nèi)的6個因素運(yùn)用Minitab 17.0軟件設(shè)計PB實驗(n=12),測定144 h后發(fā)酵液中煙曲霉素的含量,從而有效地篩選出對煙曲霉素生產(chǎn)影響較大的因素,PB實驗設(shè)計因素及水平如表1。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計因素及水平(g/L)

1.3.7 Box-Behnken Design(BBD)實驗設(shè)計 在PB和單因素實驗的基礎(chǔ)上,用Deign-Expert 8. 0. 6軟件對PB實驗得到的顯著因素進(jìn)行BB設(shè)計,并對實驗結(jié)果進(jìn)行分析,以獲得最佳培養(yǎng)基配比,BBD實驗因素與水平如表2。

表2 Box-Behnken 實驗因素與水平(g/L)

1.3.8 生物量的測定 準(zhǔn)確移取5 mL發(fā)酵液于室溫下5000 r/min離心10 min,然后轉(zhuǎn)移、保存上清液測定煙曲霉素的含量,將沉淀的菌體用蒸餾水清洗3次后于80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重,稱重,統(tǒng)計生物量。

1.3.9 煙曲霉素測定方法 樣品處理:發(fā)酵液于室溫下5000 r/min離心10 min后,取上清液,通過0.22 um的濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中,過程盡量避光。

色譜分析條件:Inertsustain ? C18反相柱,350 nm波長,柱溫25 ℃,進(jìn)樣20 μL,流速0.8 mL/min;流動相為水(A)、甲醇(B),溶劑的梯度洗脫程序是:0～2 min,A/B(V/V)=80/20;2～5 min,A/B(V/V)=70/30;5～15 min,A/B(V/V)=30/70;15～25 min,A/B(V/V)=10/90;25～27 min,A/B(V/V)=10/90;27～28 min,A/B(V/V)=80/20;28～40 min,A/B(V/V)=80/20。

煙曲霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:以煙曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品1000 mg/L為母液,甲醇色譜純?yōu)槿軇?稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、40、80、100、150、200 mg/L,每個梯度做5個平行。在色譜條件下進(jìn)行HPLC分析,以各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積y對其濃度x(mg/L)進(jìn)行線性回歸分析,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=209858x-12376,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。以峰面積為橫坐標(biāo),根據(jù)回歸方程計算煙曲霉素濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)為3次平行實驗的平均值,用Excel軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,用SPSS對各指標(biāo)包括碳源、氮源、無機(jī)鹽在內(nèi)的幾個因素進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源和氮源的篩選

碳源是微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物中碳架結(jié)構(gòu)的主要來源，為微生物的正常生長和細(xì)胞的分裂提供了物質(zhì)基礎(chǔ),適宜的碳源濃度有利于微生物的繁殖代謝；氮是組成細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要元素,適宜的碳源、氮源直接影響著代謝產(chǎn)物煙曲霉素的合成。不同碳源、氮源對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響結(jié)果圖1所示。

圖1 不同碳源、氮源對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的影響

由圖1(a)可知5種碳源發(fā)酵均能生成煙曲霉素,以甘油作為碳源時煙曲霉素產(chǎn)量最高，為58.45 mg/L,其次是可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖?？扇苄缘矸?、蔗糖和葡萄糖作為碳源發(fā)酵時煙曲霉素產(chǎn)量無顯著性差異。根據(jù)生物量變化可知,可溶性淀粉作為發(fā)酵碳源較其它碳源獲得了較高的生物量產(chǎn)量,但煙曲霉素產(chǎn)量低于甘油作為碳源時的煙曲霉素產(chǎn)量,這可能跟實際發(fā)酵操作中可溶性淀粉作為碳源發(fā)酵液易出現(xiàn)菌體結(jié)團(tuán)有關(guān),導(dǎo)致煙曲霉素產(chǎn)量降低。這跟吳升山等[18]在優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵條件時在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玻璃珠以獲得松散的菌絲體提高細(xì)胞產(chǎn)量的觀點相同。因此，甘油更有利于煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素。

圖1(b)反映出以酵母提取粉作為單一氮源時煙曲霉素和生物量同時獲得了最高產(chǎn)量。氮源有速效氮源和遲效氮源之分,對比7種氮源可以看出:煙曲霉在不同氮源條件下都能正常生長,有機(jī)氮源作為遲效氮源更有利于煙曲霉素的生產(chǎn),這可能跟有機(jī)氮源中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、小分子肽有關(guān)。氨基氮源不利于煙曲霉素的生產(chǎn),這可能是由于氨基氮源引入后導(dǎo)致發(fā)酵液pH升高不利于生成煙曲霉素。

Wen等[19]以煙曲霉NRRL2436為生產(chǎn)菌株篩選煙曲霉素生物合成的最佳碳源氮源,研究發(fā)現(xiàn)最佳的碳源組合為木聚糖30 g/L和甘露糖50 g/L,最佳氮源為L-谷氨酸9 g/L,同時指出銨鹽類物質(zhì)不適宜作為氮源。與本實驗的結(jié)果有一些相似之處,有機(jī)氮源較無機(jī)氮源更利于煙曲霉素的生成,銨鹽類氮源氯化銨不利于煙曲霉素的生成。最適碳源的不同可能是不同菌株特異性的表現(xiàn)。

綜上所述,適宜于煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的適宜碳源和氮源分別為:甘油和酵母提取粉。

2.2 初始培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

甘油、酵母提取粉、玉米粉、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KCl不同添加量對煙曲霉CEA-1701發(fā)酵產(chǎn)煙曲霉素的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同因素對煙曲霉素產(chǎn)量的影響

從圖2(a)可以看出,在以甘油作為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)煙曲霉素時,30 g/L的添加量有利于煙曲霉素合成產(chǎn)量達(dá)到50.15 mg/L,對應(yīng)的生物量達(dá)到6.98 g/L。當(dāng)甘油添加量偏離最適添加量時,煙曲霉素產(chǎn)量都有所降低。圖2(b)以酵母提取粉為氮源,在培養(yǎng)基中加入酵母提取粉明顯提高了生物量的產(chǎn)量,隨著酵母提取粉添加量的增加,煙曲霉素產(chǎn)量得到提高,在添加量為3 g/L時,煙曲霉素產(chǎn)量達(dá)到最高即51.35 mg/L,添加量繼續(xù)增加煙曲霉素產(chǎn)量反而下降,這可能是因為過量的氮源導(dǎo)致菌體徒增,溶氧降低不利于后期煙曲霉素的合成。王胤等[20]在研究三峽庫區(qū)煙曲霉IMB-SX28次級代謝產(chǎn)物時指出,1%的玉米漿添加量提高了次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。玉米漿作為生物素,不僅能夠提供微生物生長所需的微量元素,同時還能作為有機(jī)氮源,適宜的添加量能夠提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究以玉米粉代替玉米漿,由圖2(c)可以看出玉米粉的添加可以顯著提高煙曲霉素和生物量產(chǎn)量。在添加量為1.5 g/L時更有利于煙曲霉素的生成即達(dá)到55.24 mg/L,此后隨著添加量的增加煙曲霉素和生物量產(chǎn)量無顯著性差異。MgSO4·7H2O、K2HPO4適宜的添加量都有利于煙曲霉素產(chǎn)量的提高,但是組間的差異性不顯著,分別以0.5 g/L和1.5 g/L添加量時煙曲霉素產(chǎn)量達(dá)到最高為48.88 mg/L和61.58 mg/L。適宜的KCl添加量能夠提高煙曲霉素的產(chǎn)量,圖2(f)可以看出煙曲霉素產(chǎn)量隨著氯化鉀添加量的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢,添加量為0.5 g/L時煙曲霉素產(chǎn)量達(dá)到62.22 mg/L,之后隨著氯化鉀添加量的增加煙曲霉素產(chǎn)量反而下降,這可能是過高的鹽濃度改變了細(xì)胞膜的通透性[21]導(dǎo)致煙曲霉素產(chǎn)量降低。

通過以上實驗得到煙曲霉素發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:甘油30 g/L、酵母提取粉3.0 g/L、玉米粉1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO41.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.013 g/L。

2.3 Plackett-Burman(PB)實驗設(shè)計及結(jié)果分析

運(yùn)用Minitab 17.0軟件,選取甘油、酵母提取粉等影響煙曲霉素產(chǎn)量的6個因素進(jìn)行考察,PB實驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。PB設(shè)計主效應(yīng)分析如表4所示,可以看出影響煙曲霉素產(chǎn)量的重要因素為甘油、玉米粉和酵母提取粉,其中甘油的主效應(yīng)極顯著(p<0.01),其次為玉米粉和酵母提取粉。因此,將甘油、玉米粉、酵母提取粉這3個培養(yǎng)基組分作為主要因素做進(jìn)一步的響應(yīng)面法優(yōu)化。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 Plackett-Burman設(shè)計主效應(yīng)分析(g/L)

2.4 Box-Behnken Design(BB)實驗設(shè)計及結(jié)果分析

煙曲霉素培養(yǎng)基成分配方的Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果分析,用Deign-Expert 8. 0. 6軟件對實驗方案進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計,結(jié)果見表5。

表5 BBD實驗設(shè)計及結(jié)果

以煙曲霉素濃度為響應(yīng)值A(chǔ),通過Design-Expert 8. 0. 6軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析,得到響應(yīng)值A(chǔ)和因素X之間的回歸方程為:

以上二次多項回歸方程的方差分析和顯著性檢驗結(jié)果見表6。

表6 回歸方程的方差分析及其系數(shù)顯著性檢驗

用Design Expert 8.0.6軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行繪圖分析,得到響應(yīng)曲面圖和等高線圖(如圖3～圖5所示)。響應(yīng)曲面圖將任意兩個自變量對響應(yīng)值的影響直觀地反映在球面上,響應(yīng)值的最大值位于球面的最高點,等高線形狀反映兩個自變量的交互作用[22-23]。由圖3～圖5可知，X1X3對響應(yīng)值的等高線形狀呈橢圓形,這表明兩個自變量間有一定的交互效應(yīng),X1X2和X2X3的交互作用較弱。

圖3 甘油及酵母提取粉添加量影響煙曲霉素的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖4 甘油及玉米粉添加量影響煙曲霉素的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖5 酵母提取粉及玉米粉添加量影響煙曲霉素產(chǎn)量的響應(yīng)面圖及等高線圖

對回歸方程用Design Expert 8.0.6軟件分析求出最佳值,得到極值點坐標(biāo)X1=3.35,X2=0.31,X3=0.17時相應(yīng)因素的對應(yīng)值分別為:甘油33.5 g/L、酵母提取粉3.1 g/L、玉米粉1.7 g/L,預(yù)測響應(yīng)值144 h煙曲霉素濃度為66.3554 mg/L。以此條件進(jìn)行驗證實驗，發(fā)酵培養(yǎng)煙曲霉,發(fā)酵144 h測得發(fā)酵液中煙曲霉素濃度為68.51 mg/L(比預(yù)測值高3.25%),如圖6較培養(yǎng)基優(yōu)化前煙曲霉素產(chǎn)量提高了122.4%。

圖6 培養(yǎng)基優(yōu)化前后煙曲霉素產(chǎn)量對比

3 結(jié)論

碳源、氮源的篩選實驗確定了適宜煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的碳氮源分別為甘油和酵母提取粉。在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用PB分析和BBD設(shè)計響應(yīng)面實驗,通過建立模型得到較優(yōu)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為:甘油33.5 g/L、酵母提取粉3.1 g/L、玉米粉1.7 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO41.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.013 g/L。最后利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基在實驗室條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),煙曲霉CEA-1701煙曲霉素生成量達(dá)到68.51 mg/L,較培養(yǎng)基優(yōu)化前提高了122.4%。

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