響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸片球菌凍干保護(hù)劑配方

周小兵,林路英,彭 燦,何小芬,李 卉,蘇 敦,*

(1.深圳市華大農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究院,廣東深圳 518083;2.深圳華大生命科學(xué)研究院,廣東深圳 518120)

乳酸片球菌,能夠產(chǎn)生片球菌素[1],具有抑菌[2]、降低膽固醇[3]等益生功能,主要應(yīng)用在食品發(fā)酵[4]、防腐[5]等方面。益生菌是指通過(guò)攝取適當(dāng)?shù)牧?對(duì)宿主的身體健康能發(fā)揮有益作用的活菌[6],近年來(lái)由于益生菌在調(diào)節(jié)腸道、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇、抗癌等方面的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)[7],其研究和應(yīng)用越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委于2014年4月16日發(fā)布公告批準(zhǔn)乳酸片球菌為新食品原料[8],乳酸片球菌在我國(guó)正式被納入可食用益生菌范疇,大大拓展了乳酸片球菌的應(yīng)用空間。

真空冷凍干燥是生產(chǎn)和保存活細(xì)胞最有效的方法之一,在低溫下凍結(jié)物料使之成為固態(tài),然后在真空環(huán)境下使水分直接升華從而實(shí)現(xiàn)物料干燥[9]。真空冷凍干燥是冷凍和干燥技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,菌體在凍干過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷冷凍和干燥兩個(gè)過(guò)程的刺激,不可避免的會(huì)造成損傷[10]。由于冷凍而導(dǎo)致對(duì)生物系統(tǒng)的損傷主要來(lái)自于兩個(gè)方面,即細(xì)胞膜脂肪酸物理性狀的改變和相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)的改變,干燥過(guò)程對(duì)益生菌細(xì)胞造成損傷的兩大根源是膜的融合與脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變[11]。凍干前在菌懸液中加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑能有效避免冷凍和干燥過(guò)程中的細(xì)胞損傷,從而提高細(xì)胞的存活率[12]。朱奇奇等[13]采用海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、脫脂乳粉作為植物乳桿菌凍干保護(hù)劑,存活率達(dá)到83.32%;沈頤涵[14]以脫脂奶粉、甘露醇、VC-Na、味精為保護(hù)劑,嬰兒雙歧桿菌凍干存活率由43%提高到85.42%;許娜等[15]通過(guò)添加脫脂奶粉、海藻糖、甘油作為保護(hù)劑,鼠李糖乳桿菌的凍干存活率為86.69%。凍干存活率不僅受保護(hù)劑影響,微生物自身特性也會(huì)影響凍干效果,不同微生物最合適的保護(hù)劑成分和保護(hù)劑配方不同[16]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室篩選的專利菌株乳酸片球菌為研究對(duì)象,采用響應(yīng)面法進(jìn)行研究,以確定最佳凍干保護(hù)劑配方,為乳酸片球菌的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸片球菌 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號(hào)CGMCC10512;海藻糖、甘露醇 生工生物工程有限公司;硫酸錳 天津市大茂化學(xué)試劑廠;抗性淀粉 西安沛森生物科技有限公司;茶粉 廣東天池茶業(yè)股份有限公司;MRS培養(yǎng)基 美國(guó)BD DIFCO；實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

Alpha 1-4 LD plus真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ;壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;5810R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf;生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DW-86L490超低溫保存箱 青島海爾股份有限公司;Vortex-5渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司、pHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 甘油管保藏的菌體在MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落轉(zhuǎn)接到液體MRS培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,以1%的接種量轉(zhuǎn)接,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù) 將發(fā)酵液用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,選擇合適的梯度采用滾珠法涂布平板,37 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算發(fā)酵液中活菌數(shù)量。

1.2.3 冷凍干燥 菌液經(jīng)4000 r/min、4 ℃離心10 min,棄上清,加等體積0.85%的生理鹽水懸浮,相同條件下再次離心,棄上清液,濕菌體與一定配比的保護(hù)劑以1∶6的比例再懸浮,置于4 ℃冰箱預(yù)凍1 h,再置于-20 ℃冰箱預(yù)凍1 h至固化,然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱凍結(jié)1 h。凍干機(jī)開機(jī)預(yù)凍5 min至溫度降為-55 ℃,將處理好的菌體轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)凍干24 h,即獲得凍干粉[17]。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn) 選取海藻糖濃度、甘油濃度、甘露醇濃度、可溶淀粉濃度、抗性淀粉濃度、乙酸鈉濃度、硫酸錳濃度、茶粉濃度八個(gè)因素設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),按表2配方配制保護(hù)劑,冷凍干燥,比較凍干存活率。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素與水平(g/L)

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程只有在考察區(qū)域才能充分近似真實(shí)情形,首先需要逼近最佳區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。針對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)所得顯著因素海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度,根據(jù)效應(yīng)的大小及正負(fù)設(shè)定步長(zhǎng)和變化方向,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),冷凍干燥,比較凍干存活率。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 以凍干存活率為響應(yīng)值,針對(duì)顯著影響因素海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn),按表2因素與水平配制保護(hù)劑,冷凍干燥,比較凍干存活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab軟件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行顯著性分析;采用Design Expert軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)回歸擬合。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選顯著影響因素

根據(jù)表3結(jié)果比較各因素顯著性,結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)

由表4可知，各因素對(duì)凍干存活率影響顯著性排列：海藻糖濃度>甘露醇濃度>硫酸錳濃度>甘油濃度>可溶淀粉濃度>茶粉濃度>乙酸鈉濃度>抗性淀粉濃度,其中海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度對(duì)凍干存活率影響顯著。眾多研究表明海藻糖能對(duì)微生物細(xì)胞起很好的保護(hù)作用[17-19],關(guān)于海藻糖、甘露醇等多羥基物質(zhì),其保護(hù)作用有幾種假說(shuō):一種是改變了膜相變溫度,當(dāng)磷脂干燥脫水時(shí),海藻糖在失水部位以氫鍵和磷脂的極性端相連,防止?fàn)顟B(tài)的轉(zhuǎn)變和復(fù)水時(shí)的滲漏,從而提高存活率[20];另一種是影響體系玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,海藻糖能夠促進(jìn)玻璃體的形成,減少對(duì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞有破壞作用的冰晶的生成,從而提高被保存物質(zhì)的穩(wěn)定性[21]。海藻糖t值為負(fù)說(shuō)明對(duì)響應(yīng)值有負(fù)效應(yīng),濃度應(yīng)遞減,甘露醇和硫酸錳為正,濃度應(yīng)遞增。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域

通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了對(duì)菌體凍干存活率影響最大的三個(gè)因素:海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度,最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示，海藻糖濃度70 g/L,甘露醇濃度40 g/L,硫酸錳濃度1.5 g/L在最大響應(yīng)值區(qū)間。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及響應(yīng)面分析

表6顯示了Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)其進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表7所示。

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

圖1 海藻糖和甘露醇交互作用對(duì)菌體存活率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖2 海藻糖和硫酸錳交互作用對(duì)菌體存活率影響的等高線及響應(yīng)面圖

圖3 硫酸錳和甘露醇交互作用對(duì)菌體存活率影響的等高線及響應(yīng)面圖

以存活率最高為條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)解:海藻糖濃度為73.64 g/L,甘露醇濃度為43.76 g/L,硫酸錳濃度為1.91 g/L,預(yù)測(cè)凍干存活率為98.72%。采用優(yōu)化得到的結(jié)果進(jìn)行三次凍干驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到存活率為98.10%±1.03%,與預(yù)測(cè)值接近,說(shuō)明該優(yōu)化方法可信度較高,可以用來(lái)進(jìn)行保護(hù)劑配方的篩選和優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)響應(yīng)面法篩選和優(yōu)化了乳酸片球菌冷凍干燥保護(hù)劑配方。首先通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)研究8種保護(hù)劑成分對(duì)凍干存活率的影響,從中找出了影響顯著的三個(gè)因素:海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度。然后通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近了最大響應(yīng)區(qū)域,最后通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)擬合出一個(gè)三元二次多項(xiàng)式方程,找到了最佳配方:海藻糖濃度為73.64 g/L,甘露醇濃度為43.76 g/L,硫酸錳濃度為1.91 g/L,其中海藻糖濃度和甘露醇濃度具有顯著的交互作用,將優(yōu)化的配方進(jìn)行凍干驗(yàn)證,乳酸片球菌凍干存活率為98.10%±1.03%，與預(yù)測(cè)值98.72%接近。該配方存活率高,具有較高應(yīng)用價(jià)值。

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