結(jié)縷草新品種DUS測試數(shù)量性狀特異性判別

羅涵夫，齊 曉，麥靖雯，張巨明

(1.華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642； 2.廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；3.全國畜牧總站全國草品種審定委員會辦公室，北京100125)

在知識和經(jīng)濟全球化迅猛發(fā)展的大背景下，我國農(nóng)產(chǎn)品在質(zhì)量、價格和知識產(chǎn)權(quán)保護等方面面臨著全球化帶來的激烈競爭。因此建立以知識產(chǎn)權(quán)保護為基礎(chǔ)的植物新品種保護體系，對提高我國農(nóng)產(chǎn)品國際競爭力有著重要作用[1]。截至2016年4月，農(nóng)業(yè)部已公布了9批、93種植物新品種保護名錄，授予新品種權(quán)7 443個，有效品種權(quán)5 209件；國家林業(yè)局已公布5批、198種植物新品種保護名錄，授予新品種權(quán)913個[2]。我國新品種保護工作取得了巨大的進展。

對植物新品種的特異性(distinctness)、一致性(uniformity)和穩(wěn)定性(stability)測試，簡稱DUS測試，由國際植物新品種保護聯(lián)盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants,UPOV)提出，其是植物新品種保護的技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)依據(jù)[3]。美國、歐洲和日本等國家研究較早，我國直到1998年才開始DUS測試研究及測試工作[4]。1997年10月1日，我國頒布《植物新品種保護條例》，規(guī)定品種授權(quán)必須具有新穎性、特異性、一致性和穩(wěn)定性。開展新品種保護的技術(shù)條件是建立新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性的測試體系。截至2015年，我國共開展366個測試指南的研制工作,已完成了186種植物的DUS測試指南研制，發(fā)布了16種植物DNA指紋圖譜鑒定方法[5]。而UPOV已經(jīng)開展了592個測試指南的研制工作，頒布了281個種屬(2013年)的測試指南；日本也開展了500多個種屬的指南研制工作[1]。

結(jié)縷草屬(Zoysia)隸屬于禾本科(Gramineae)，包括11個種和部分變種和變型，我國有5個種、2個變種、1個變型，其中5個種為結(jié)縷草(Z.japonica)、中華結(jié)縷草(Z.sinica)、大穗結(jié)縷草(Z.macrostachya)、溝葉結(jié)縷草(Z.matrella)和細葉結(jié)縷草(Z.tenuifolia)，2個變種為長花結(jié)縷草(Z.sinicavar.nipponica)和青結(jié)縷草(Z.japonicavar.pollida)，1個變型為大穗日本結(jié)縷草(Z.japonicaf.macrostachya)[6-7]。結(jié)縷草原產(chǎn)于我國，是我國重要的草坪草種質(zhì)資源，其抗逆性強，耐磨，對水肥需求低，被公認為環(huán)境友好型草坪草，廣泛應(yīng)用于亞熱帶和溫帶地區(qū)。結(jié)縷草屬植物于2014年被中國農(nóng)業(yè)部列入第10批新品種保護名錄，同年4月，農(nóng)業(yè)部頒布實施《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南結(jié)縷草屬》農(nóng)業(yè)行業(yè)標準，這為我國結(jié)縷草品種保護工作奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)國家草品種區(qū)域試驗的要求，從2016年開始對申報品種在區(qū)域試驗的基礎(chǔ)上還需進行DUS測試。但由于我國結(jié)縷草DUS測試指南2014年才頒布，還未見對結(jié)縷草新品種的測試報道。華南農(nóng)業(yè)大學2016年接受了農(nóng)業(yè)部2個結(jié)縷草申請品種的DUS測試任務(wù)，首次按結(jié)縷草屬DUS測試指南，對結(jié)縷草進行了連續(xù)2個獨立生長周期DUS測試，從12個數(shù)量性狀中選取8個需要測量的數(shù)量性狀進行分析，以期驗證、優(yōu)化結(jié)縷草DUS測試判定方法，為結(jié)縷草新品種DUS測試性狀的判定提供更可靠充分的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料共10份(表1)，分別為不同的種、品種(系)，其中測試申請品種2個，分別為廣綠結(jié)縷草(以下簡稱廣綠)、Z0413-1雜交結(jié)縷草(以下簡稱Z0413-1)；對應(yīng)的近似品種2個，分別為蘭引Ⅲ號結(jié)縷草(以下簡稱蘭引Ⅲ號)、Diamond結(jié)縷草(以下簡稱Diamond)；以及6個標準品種，分別為大穗結(jié)縷草、青島結(jié)縷草、中華結(jié)縷草、溝葉結(jié)縷草、細葉結(jié)縷草和蘭引Ⅱ號結(jié)縷草。供試材料均為營養(yǎng)莖。

1.2 試驗設(shè)計

申請品種和近似品種相鄰種植。種植分為單株種植(單株區(qū))和密植種植(密植區(qū))。單株區(qū)每個品種種植15株，株行距1.5 m；密植區(qū)小區(qū)面積1 m×2 m，株行距5 cm×15 cm，設(shè)置2個重復(fù)。

1.3 試驗實施

試驗地位于廣東增城華南農(nóng)業(yè)大學寧西實驗基地，海拔約41 m，地形平坦，坡向西南，土壤類型為壤土，土壤有機質(zhì)含量1.65%，速效N含量12.25 clamg·kg-1，速效P含量49.08 mg·kg-1，速效K含量142.02 mg·kg-1，土壤pH 6.61。試驗時間為2016年7月10日到2017年9月30日，連續(xù)進行兩個年度兩個完整生長周期的測試。種植采用營養(yǎng)莖繁殖方式，取含2～3個莖節(jié)、長5～8 cm、生長一致的營養(yǎng)莖扦插。單株區(qū)每穴扦插3枝，深度3～5 cm，成活后保留1枝，用于觀測；密植區(qū)按株行距扦插，深度3～5 cm。田間管理按常規(guī)管理措施，每月施肥一次，施用“挪威牌”復(fù)合肥(總養(yǎng)分45%；N、P、K養(yǎng)分比例各占15%)，施肥量為30 g·m-2；每周澆水1～2次；根據(jù)小區(qū)具體生長情況及時拔除雜草并開展病蟲害防治；單株區(qū)不修剪，密植區(qū)修剪，生長季節(jié)每周修剪一次，剪草高度3～5 cm。

表1 結(jié)縷草DUS測試品種材料名稱Table 1 Names of Zoysiagrass varieties for DUS testing

1.4 測定指標及方法

試驗按照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南結(jié)縷草屬》[8]，從12個數(shù)量性狀中剔除4個目測數(shù)量性狀(即測試指南中觀測方法為VG或VS),選取植株自然高度和匍匐莖節(jié)間長度等8個需要測量的數(shù)量性狀(即測試指南中觀測方法為MG或MS)。數(shù)量性狀用直尺、游標卡尺和電子天平測量(表2)，并進行代碼法分級和統(tǒng)計分析。

代碼法是指對于某個特定的性狀，依據(jù)種植試驗中記錄的品種表達狀態(tài)進行特異性評價。測試指南中每一個數(shù)量性狀都規(guī)定了不同的分級及相應(yīng)代碼和描述，測量標準品種，使用公式(1)計算得到數(shù)量性狀分級的級差。

R=(Vi-Vj)/(Ci-Cj)。

(1)

式中：R為數(shù)量性狀分級的級差，Vi、Vj為該性狀標準品種測量均值，Ci、Cj為標準品種對應(yīng)的代碼。

分級范圍的上下限通過公式(2)、(3)計算得到。

S上=(n-i+0.5)×R+Vi；

(2)

S下=(n-i-0.5)×R+Vi。

(3)

式中：S上、S下為代碼n對應(yīng)分級范圍的上限和下限，i為標準品種對應(yīng)的代碼，R為級差，Vi為標準品種測量均值。

再測量申請品種，根據(jù)其所屬的分級范圍，最后確定其對應(yīng)的代碼及描述。申請品種與其近似品種代碼和描述相同，則表示沒有差異，反之表示有差異。

統(tǒng)計分析采用Excel 2010、SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行處理及兩個獨立樣本的t檢驗，在0.05水平下進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)量性狀測試結(jié)果

從2016年7月到2017年9月，對結(jié)縷草測試材料8個數(shù)量性狀連續(xù)兩個生長季做DUS測試，結(jié)果表明，無論是標準品種，還是測試種或近似種，年度間性狀表現(xiàn)差異很大(表3)。

2.2 代碼法分析

在2016年至2017年連續(xù)兩年測試中，通過測量測試指南規(guī)定的標準品種，分別計算得到2016年和2017年8個數(shù)量性狀的不同代碼所對應(yīng)的分級范圍(表4、表5)。

表2 結(jié)縷草DUS測試數(shù)量性狀及觀測方法Table 2 Quantitative characteristics and methods for zoysiagrass DUS testing

MG，群體測量； MS，個體測量； PNH，植株自然高度；SLOI，匍匐莖節(jié)間長；SD,匍匐莖直徑；LL,葉長；LW,葉寬；IL,花序長度；INOS,花序小穗數(shù)；KGW,千粒重。下同。

MG, measurement of a group of plants or parts of plants; MS, measurement of a number of individual plants or parts of plants; PNH, plant natural height; SLOI, stolon length of internode; SD, stolon diameter; LL, leaf length; LW, leaf width; IL, inflorescence length; INOS, Inflorescence numbers of spikelet; KGW, kilo grain weight. similarly for the following tables.

表3 結(jié)縷草DUS測試數(shù)量性狀測試結(jié)果Table 3 Results of quantitative characteristics measurement of zoysiagrass DUS testing

標準品種i和標準品種j為測試指南所選定的對應(yīng)性狀的2個標準品種。

Standard varietyiand standard varietyjare two standard varieties for corresponding characteristics.

根據(jù)表4和表5測定分級范圍及代碼，分別對表3測定結(jié)果進行特異性判別，得到2016年和2017年兩個測試種的特異性判別結(jié)果(表6)。2016年度申請品種廣綠與其近似品種有5個性狀有差異，其中匍匐莖節(jié)間長、葉長、種子千粒重3個性狀的差異大于1個級差；而申請品種Z0413-1與其近似品種有3個有差異的性狀，分別為匍匐莖節(jié)間長、葉寬、花序小穗數(shù)，但3個有差異的性狀級差均為1(表6)。2017年度申請品種廣綠與其近似品種僅有4個有差異的性狀。2016年與2017年相比，性狀匍匐莖節(jié)間長，葉長，葉寬3個性狀在兩年獨立的測試中均表現(xiàn)為有差異，而株高、花序長和種子千粒重3個性狀僅在一年中表現(xiàn)出差異；申請品種Z0413-1與其近似品種在匍匐莖節(jié)間長和花序小穗數(shù)2個性狀在兩年獨立的測試中均表現(xiàn)為有差異，而性狀株高和葉寬僅在一年中有差異。

表4 2016年測試數(shù)量性狀分級范圍及代碼Table 4 Scales and notes of quantitative characteristics in 2016

表5 2017年測試數(shù)量性狀分級范圍及代碼Table 5 Scales and notes of quantitative characteristics in 2017

2.3 數(shù)理統(tǒng)計分析

對數(shù)量性狀測定結(jié)果進行t檢驗(表7)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，2016年度申請品種廣綠與其近似品種在匍匐莖節(jié)間長、葉寬、葉長、花序長和種子千粒重5個性狀上有顯著差異差異(P<0.05)；2017年度廣綠匍匐莖節(jié)間長、葉長和種子千粒重3個性狀上存在顯著差異(P<0.05)。

2016年度申請品種Z0413-1與其近似品種在匍匐莖節(jié)間長、葉寬、花序長、花序小穗數(shù)和種子千粒重5個性狀上存在顯著差異(P<0.05)。2017年度的測試中，在株高、匍匐莖節(jié)間長、葉片長、葉寬、花序長度、花序小穗數(shù)和種子千粒重7個性狀上存在顯著差異(P<0.05)。

2.4 代碼法和數(shù)理統(tǒng)計法分析結(jié)果對比

代碼法和數(shù)理判別結(jié)果不盡相同(表8)。代碼法判定有特異性的數(shù)量性狀不一定在統(tǒng)計學上有顯著差異，而判定為沒有特異性的數(shù)量性狀在統(tǒng)計學上卻有顯著差異。

表6 數(shù)量性狀代碼法判別結(jié)果Table 6 Results ofquantitative characteristicswith the note method

Y，具備特異性；N，不具備特異性。下同。

Y, With distinctness; N, without distinctness; similarly for the following tables.

從對比結(jié)果可以看出，2016年度申請品種廣綠與其近似品種的統(tǒng)計結(jié)果與“代碼”法判別結(jié)果完全相同，而2017年度的測試在株高和葉寬上兩種方法判定有差異。2016年度申請品種Z0413-1與其近似品種的統(tǒng)計結(jié)果和代碼法判別結(jié)果基本一致，在花序長和種子千粒重上兩種方法判定有差異。而2017年度的測試中在葉長、葉寬、花序長和種子千粒重4個性狀上，代碼法判定沒有特異性，而t檢驗結(jié)果顯示差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

數(shù)量性狀是以一維的、線性等級進行描述的性狀，這種一維、線性和連續(xù)變化的特性決定了該性狀不能單純依靠性狀所處的分級范圍相同與否來判斷申請品種與其近似品種特異性有無[9]。本研究結(jié)果證明了這一點：部分處于相鄰分級范圍的數(shù)量性狀，實際上并沒有顯著性差異，如廣綠的葉寬，株高等就屬于這種情況。2017年度申請品種廣綠葉片寬度(3.84 mm)與其近似品種蘭引Ⅲ號葉片寬度(4.28 mm)之間無顯著差異(P<0.05)，卻落入了分級邊界(3.9 mm)左右，被賦予了‘6’和‘7’兩個不同的描述代碼。為了避免兩個品種都非常接近同一分級值(如代碼6的上端和代碼7的下端)導致的代碼法和數(shù)理統(tǒng)計法判定出現(xiàn)差異，陳海榮和顧曉君[10]認為，在符合一致性和穩(wěn)定性要求的情況下，若申請品種與其近似品種的性狀取值的平均數(shù)分別處于非相鄰的分級范圍，或者處于相鄰分級范圍，但兩者之間的差值大于該性狀的級差時，則認定兩者存在明顯差異，說明申請品種具備特異性；若申請品種與其近似品種的性狀取值的平均數(shù)處于相鄰的分級范圍，且兩者之間的差值小于或等于該性狀的級差時，即可認定申請品種與其近似品種間不存在顯著差異，說明申請品種不具備特異性。但這也不是判定特異性的絕對標準。隨著育種技術(shù)的日新月異，新品種之間的差異較測試指南制定時，品種間的差異更加精細，而且受品種測試地點、年份、環(huán)境差異或表達程度等因素的影響[11]。

為確保數(shù)量性狀特異性判別結(jié)果的科學性和客觀性，本研究在代碼法判別的基礎(chǔ)上，進一步進行了數(shù)理統(tǒng)計分析，對特異性進行綜合判定。數(shù)量性狀特異性判定既要符合DUS測試特異性判別要求，又要同時滿足統(tǒng)計學上差異顯著性要求，可分3種情形判定。第一，如果某一數(shù)量性狀在2個年度的測試中2種判定方法均判定為有差異，則可認為申請品種在該性狀上具備特異性，如廣綠結(jié)縷草測試中的性狀匍匐莖節(jié)間長、葉長和Z0413-1結(jié)縷草測試中的性狀匍匐莖節(jié)間長、花序小穗數(shù)；第二，如果某一數(shù)量性狀在2個年度的測試中數(shù)理統(tǒng)計分析均有差異且僅有其中1個年度的代碼法判定沒有差異，也可認為申請品種在該性狀上具備特異性，因為這極有可能是兩個品種該年度的測量值很接近同一分級邊界值導致代碼法判定沒有差異，只能通過數(shù)理統(tǒng)計方法進行判定，如廣綠結(jié)縷草測試中的種子千粒重和Z0413-1結(jié)縷草測試中的葉寬；第三，其他情況，如代碼法判別連續(xù)2個年度均沒有特異性，統(tǒng)計法連續(xù)2個年度均沒有顯著差異，代碼法判別有1個年度有特異性但統(tǒng)計法連續(xù)2個年度均沒有顯著差異等，均不能判定申請品種在該性狀上具備特異性。根據(jù)以上判別原則，本研究申請品種廣綠結(jié)縷草與其近似品種蘭引Ⅲ號結(jié)縷草相比，在匍匐莖節(jié)間長、葉長和種子千粒重3個數(shù)量性狀上具備特異性；申請品種Z0413-1結(jié)縷草與其近似品種Diamond結(jié)縷草相比，在匍匐莖節(jié)間長、花序小穗數(shù)和葉寬3個數(shù)量性狀上具備特異性。

表7 數(shù)量性狀t檢驗結(jié)果Table 7 T-test result of quantitative characteristics

數(shù)據(jù)后“*”表示申請品種與近似品種該性狀在0.05水平上有顯著差異。

Value with ‘*’ indicate significant differences among candidate variety and selecting variety at the 0.05 level.

表8 測量性狀t檢驗和代碼法結(jié)果對比Table 8 Quantitative characteristics comparison between t-test result and note assessment

國外的DUS測試起步早，特異性判別方法較為專業(yè)、系統(tǒng)和先進。針對植物新品種DUS測試自身特性，UPOV有關(guān)專家研制出了一種跨年度綜合特異性的方法(Combined Over-Years Distinctness Criterion,COYD)。該方法考慮到了年度間的變異，主要用于異花授粉品種，也可以用于自花授粉和無性繁殖品種。除此之外，還開發(fā)了數(shù)據(jù)庫自動篩選程序(GAIA法)，該程序可以完成不同品種(尤其是成對材料)間數(shù)量性狀、質(zhì)量性狀和電泳測試性狀的分析比較，對于申請品種和近似品種過于相近的情況具有較好的辨別和分析能力[12]。除了傳統(tǒng)的DUS測試，DNA分子標記技術(shù)已經(jīng)廣泛地用于植物新品種鑒定和檢測試驗中。李汝玉等[13]認為，SSR標記是植物品種特異性鑒定的最好方法。已成功運用于油菜(Brassicanapus)[14]、小麥(Triticumaestivum)[15]、大麥(Hordeumvulgare)[16]和西瓜(Citrulluslanatus)[17]等多種作物的DUS測試。目前，我國玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)品種鑒定的指紋方法已經(jīng)成為國家標準[1]。草品種中的柱花草(Stylosanthesspp．)[18]、牛鞭草(Hemarthriaaltissima)[19]和苜蓿(Medicagosativa)[20]也已經(jīng)完成了DNA指紋圖譜的構(gòu)建。我國DUS測試研究及實施較晚，還沒有COYD等測試方法的報道，今后除了完善符合國情的DUS測試體系，加快DNA指紋圖譜的構(gòu)建，還要借鑒國外成熟的經(jīng)驗，盡早開展COYD研究工作，并開發(fā)我國自己的GAIA程序，這應(yīng)該是我國DUS測試的研究方向。

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