樂果和銅、砷（Ⅲ）對費氏弧菌的聯(lián)合毒性效應研究

李雪飛 黃永炳 袁孟杰 孟一鳴 徐恒蒲

摘 要：在實驗室條件下，研究3種污染物質銅（Cu）、砷（As）和農(nóng)藥樂果（Dimethoate）對費氏弧菌（V. fischeri）的單一毒性和聯(lián)合毒性效應。單一毒性實驗結果表明，3種污染物質對費氏弧菌的毒性大小為Cu>As（Ⅲ）>樂果。3種物質對費氏弧菌的15min半數(shù)致死濃度（Median effective concentration，EC50）分別為2.04、5.23、523.99mg/L。利用毒性單位（Toxicity unit， TU）法、相加指數(shù)（Additive index， AI）法和混合毒性指數(shù)（Mixtures toxicity index， MTI）法對混合樣本進行了定性評價，結果表明，在二元混合體系中，不同毒性單位的樂果與Cu均表現(xiàn)為協(xié)同作用，不同毒性單位的樂果與As（Ⅲ）部分表現(xiàn)為拮抗作用。樂果-Cu-As（Ⅲ）的三元混合體系的聯(lián)合作用表現(xiàn)為部分相加作用和協(xié)同作用。

關鍵詞：樂果；銅；砷；聯(lián)合毒性；費氏弧菌

當今世界，在農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)中，重金屬和有機物質被大量使用。隨著諸如Cu、As等有毒重金屬和農(nóng)用化學品如有機農(nóng)藥、人工飼料和化肥先后或同時進入自然環(huán)境，并通過各種途徑直接或間接進入水體，彼此產(chǎn)生聯(lián)合作用，從而對水體環(huán)境造成復合污染[1]。發(fā)光細菌是一種能夠發(fā)出可見光的細菌，利用其發(fā)光強度的變化，可以反映環(huán)境中的綜合毒性[2]。發(fā)光細菌毒性檢測法具有操作簡單、反應迅速、結果靈敏、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，故被廣泛地運用到環(huán)境中污染物質的毒性檢測領域。目前利用發(fā)光菌作為受試生物對重金屬和有機磷農(nóng)藥聯(lián)合毒性的研究內容涉及較少，深度較淺。而由于對重金屬和有機磷農(nóng)藥的混合體系聯(lián)合作用效應未知，導致重金屬和有機磷農(nóng)藥的混合物已經(jīng)對環(huán)境造成了嚴重的破壞，因此，進行重金屬和有機農(nóng)藥的聯(lián)合毒性效應研究刻不容緩。

本實驗使用費氏弧菌作為受試生物，使用三種評價方法評價基于樂果和銅、砷（Ⅲ）的聯(lián)合毒性效應，為環(huán)境影響評估提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

GloMax20/20型生物發(fā)光檢測儀；高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫振蕩箱；費氏弧菌（V. fischeri）凍干粉購于北京濱松光子技術股份有限公司；樂果，有效成分含量為50%；硫酸銅（CuSO4·5H2O），分析純；三氧化二砷（As2O3），分析純。

1.2實驗方法

1.2.1單一毒性的測定

配制不同濃度的待測液。每個濃度設置一個空白對照組和三個平行實驗組，按菌液體積：待測溶液體積=1：9，測量15min后，費氏弧菌的發(fā)光強度，并計算其發(fā)光抑制率。

1.2.2聯(lián)合毒性的測定

采用等毒性濃度配比法[3]，以樂果+Cu、樂果+As（Ⅲ）毒性單位比分別為1：1、1：2、2：1的比例設置質量濃度梯度，以樂果+Cu+As（Ⅲ）毒性單位比分別為1：1：1、2：1：1、1：2：1、1：1：2的比例設置濃度梯度，測定混合物對費氏弧菌的聯(lián)合毒性效應。

1.3聯(lián)合毒性的評價方法

1.3.1毒性單位（TU）法

式中：Ci為造成生物半致死時混合物中的i組分的濃度；EC50，i為單一受試樣本i的EC50值。TUi為混合污染物中的i組分的毒性單位，TUi，max為混合物中各組分的毒性單位最大值。利用M與M0來評價聯(lián)合毒性效應類型：M=1時為簡單相加作用；1M0時為拮抗作用。

1.3.2相加指數(shù)（AI）法

當M≤1時，AI=1/M-1；當M>1時，AI=1-M。AI法的評價標準為：當AI=0時，為相加作用；當AI<0時，為拮抗作用；當AI>0時，為協(xié)同作用。

1.3.3混合毒性指數(shù)（MTI）法

MTI=1-lgM/lgM0

基于MTI值的評價標準為：當MTI=1時，為簡單相加作用；當MTI<0時，為拮抗作用；當MTI>1時，為協(xié)同作用；當0

2 結果與討論

作用15min時，樂果、Cu和As（Ⅲ）對費氏弧菌的EC50分別為523.99、2.04、5.23mg/L。

2.1二元聯(lián)合毒性效應研究

樂果分別與Cu、As（Ⅲ）對費氏弧菌的二元聯(lián)合毒性效應實驗結果如表1所示。

分別使用TU法、AI法和MTI法評價受試物的聯(lián)合毒性，結果如表2、表3所示。

在樂果-Cu的二元混合體系中，三種評價方法均表現(xiàn)為協(xié)同作用。由表2可知，隨著Cu的比例的提高，M值遞減，AI值遞增，表明在樂果-Cu的混合體系中，Cu濃度越高，協(xié)同作用程度越大。其原因可能是樂果溶液呈弱酸性，會在一定范圍內降低混合溶液的pH，故導致Cu2+的解析量增大。另外，Cu2+在混合物中所占比例大、濃度高時，會導致膜脂質過氧化，細胞膜的通透性上升[4]，利于Cu2+和樂果滲入細胞膜內產(chǎn)生毒害作用，使得二元毒性逐漸增強。

由表3可以得出，在樂果-As（Ⅲ）的二元混合體系中，當樂果所占比例較少時，TU法和MTI法的評價結果均為部分相加作用，而AI法的評價結果為拮抗作用；當樂果所占比例較大時，三種評價方法的結果均為拮抗作用。其原因可能是樂果溶液呈弱酸性，As（Ⅲ）在溶液中是以AsO3-3的形式存在的，當混合溶液中樂果的比例較大時，H+的濃度也較大，故此時，溶液中的AsO3-3較容易與H+結合生成較為穩(wěn)定的H3AsO3，而大部分的化學物質在以穩(wěn)定的化合態(tài)形式存在時的毒性小于其在以離子態(tài)形式存在時的毒性，故此時，混合溶液的毒性出現(xiàn)了一定程度的減弱，所以當樂果所占比例較大時，三種評價方法的結果均表現(xiàn)為輕微的拮抗作用。

2.2三元聯(lián)合毒性效應研究

樂果-Cu-As（Ⅲ）三元混合體系聯(lián)合毒性評價結果如表4、5所示。

由表5可知，在樂果-Cu- As（Ⅲ）的三元混合體系中，當混合物中Cu2+所占比例較高時，三種評價方法結果均表現(xiàn)為協(xié)同作用，而當混合物中Cu2+所占比例較低時，TU法與MTI法的評價結果均為部分相加作用，AI法的評價結果為拮抗作用，表明此時協(xié)同作用減弱。其原因可能是在樂果-Cu-As（Ⅲ）三元體系中，樂果與Cu表現(xiàn)為協(xié)同作用，樂果與As（Ⅲ）表現(xiàn)為拮抗作用，而樂果與Cu的協(xié)同作用程度大于樂果與As（Ⅲ）的拮抗作用程度，另外，Cu2+可以增加細胞膜的通透性，故當混合比例為1：1：1和1：2：1時，混合體系表現(xiàn)為協(xié)同作用。而當混合溶液中樂果和砷的比例較大時，Cu2+濃度較低，細胞膜的通透性可能會微弱上升，但并不足以使毒性物質直接進入細胞內，故此時協(xié)同作用程度較小，混合體系表現(xiàn)出部分相加作用，另外，當混合體系中樂果所占比例越高時，其與砷發(fā)生的拮抗作用越強，故混合體系越偏向于拮抗作用。

3 結論

（1）在單一毒性物質的作用下，15min時，樂果和Cu、As（Ⅲ）對費氏弧菌的EC50分別為523.99、2.04、5.23mg/L。毒性大小順序依次為Cu>As（Ⅲ）>樂果。

（2）在二元聯(lián)合毒性效應實驗中，不同毒性單位的樂果與Cu均表現(xiàn)為協(xié)同作用，樂果與As（Ⅲ）表現(xiàn)為部分相加作用與拮抗作用。在三元聯(lián)合毒性效應實驗中，樂果-Cu-As（Ⅲ）表現(xiàn)為部分相加作用和協(xié)同作用。上述的實驗結果均表明混合后毒性在大多數(shù)情況下均有一定程度的增強，在生產(chǎn)中需要引起重視。

（3）若混合體系中毒性物質的種類相同，但毒性配比不同，其對費氏弧菌的聯(lián)合毒性作用也不完全相同，有時可能存在較大的差異。這說明在混合體系中，隨著某種物質的比例發(fā)生改變，其聯(lián)合作用也會隨之而發(fā)生變化。

參考文獻

[1]潘攀，楊俊誠，鄧仕槐，等. 重金屬與農(nóng)藥復合污染研究現(xiàn)狀及展望[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報， 2011， 30（10）：1925-1929.

[2]Ma X Y，Wang X C， Ngo H H， et al. Bioassay based luminescent bacteria： interferences， improvements， and applications[J]. Science of the Total Environment， 2014， 468-469（Complete）：1-11.

[3]錢驍，劉瑞志， 雷坤，等. 等毒性配比法研究甲醛與重金屬的聯(lián)合毒性效應[J].環(huán)境污染與防治， 2014（5）.

[4]楊亞琴，賈秀英.Cu2+、Zn2+和Cd2+對蟾蜍蝌蚪的聯(lián)合毒性[J].應用與環(huán)境生物學報，2006，12（3）：356-359.

作者簡介

李雪飛（1993-），男，漢族，湖北咸寧，研究生在讀，學士，武漢理工大學，主要研究方向：水處理。