紫花苜蓿9個鹽響應(yīng)相關(guān)基因表達模式

張亞玲，張 攀，尹 航，王 洋，孫 杰，吳清瑩，付佳琦，崔國文

(東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

土壤鹽堿化是造成全球作物產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的主要非生物脅迫之一。鹽漬化土地是我國重要的、具有潛在利用價值的邊際土地資源，總面積約有3 667萬hm2，其中鹽漬化耕地近670萬hm2，約占全國總耕地的5%[1-2]。由于氣候變化和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)活動的影響，我國鹽堿化土壤的面積呈現(xiàn)日益擴大的趨勢，而土地鹽堿化造成的土壤理化性質(zhì)變差、土地利用率降低、草地產(chǎn)量下降等問題嚴重威脅到農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)[3-4]。

牧草是可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要組成部分，隨著我國農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，草地畜牧業(yè)的發(fā)展使苜蓿在牧草產(chǎn)業(yè)中成為主導產(chǎn)業(yè)。紫花苜蓿(Medicagosativa)產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應(yīng)性強，是全球性栽培的豆科苜蓿屬多年生草本植物，長期以來在生態(tài)治理、畜牧業(yè)發(fā)展和種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮著重要作用[5-6]。但鹽脅迫會顯著降低紫花苜蓿的產(chǎn)量，培育耐鹽新品種是降低鹽漬化土地對紫花苜蓿生長和產(chǎn)量影響的有效途徑[7-8]。

植物的耐鹽性是一個非常復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及到多基因和多種耐鹽機制的協(xié)調(diào)作用[9-10]。隨著分子生物學的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進步，植物抗逆性研究已從傳統(tǒng)的生理指標測定轉(zhuǎn)變?yōu)閷ζ浞肿訖C理的闡釋[11-12]。Winicov和Button[13]分析了鹽脅迫對紫花苜蓿光合作用相關(guān)基因表達的影響，結(jié)果顯示，光合作用相關(guān)葉綠體基因psdD、psaB、atpB、rbcL以及核基因pCab4、pCab1、rbcS在紫花苜蓿中的表達增強。因此，全面研究并了解紫花苜蓿的鹽相關(guān)基因的表達模式有助于紫花苜蓿耐鹽分子育種。為此，基于鹽脅迫下紫花苜蓿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，通過生物信息學分析篩選出9個鹽響應(yīng)相關(guān)蛋白，在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中Blast其對應(yīng)的編碼基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，用熒光定量PCR分析不同濃度NaCl脅迫處理、不同處理時間后其在紫花苜蓿中的表達模式，研究結(jié)果可為紫花苜蓿耐鹽研究提供候選基因，并為研究其耐鹽分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗用紫花苜蓿種子為龍牧801(Longmu 801)，由東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院草業(yè)科學實驗室提供。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

選取籽粒飽滿、健康的紫花苜蓿種子，用5%的次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗4～5次后置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，放入人工培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，相對濕度60%～75%，培養(yǎng)溫度25 ℃/20 ℃(日/夜)，待苜蓿子葉展開后轉(zhuǎn)入自制的苜蓿培養(yǎng)槽中，用改良的Hoagland營養(yǎng)液水培[14]，每2 d換一次培養(yǎng)液。二周齡的紫花苜蓿幼苗轉(zhuǎn)入NaCl濃度為0、0.2%、0.4%、0.8%的營養(yǎng)液中進行鹽脅迫處理，處理時間分別為0、1、2、4、8 h，取整株幼苗為試驗材料，樣品立即進入液氮中冷凍處理并儲存在-80 ℃冰箱中直至使用。每個處理設(shè)4個生物學重復(fù)。

1.3 總RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄

紫花苜蓿幼苗總RNA用TIANGEN的RNAprep Pure 植物總RNA提取試劑盒提取，用1%瓊脂糖凝膠檢測其完整性(圖1a)，用微量分光光度計進行濃度的測定。RNA的反轉(zhuǎn)錄用的HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 試劑盒(Vazyme，中國)進行，cDNA質(zhì)量用Taq酶(Vazyme，中國)進行普通PCR鑒定(圖1b)。

1.4 鹽響應(yīng)相關(guān)基因

鹽響應(yīng)相關(guān)基因的選擇以前期獲得的紫花苜蓿鹽脅迫下差異表達蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)[4]，通過生物信息分析差異蛋白的分子功能、參與的生物過程和代謝通路，然后篩選出9個鹽響應(yīng)相關(guān)蛋白，并在NCBI中Blast其對應(yīng)基因的編碼序列和登錄號，獲得鹽響應(yīng)相關(guān)基因(表1)。

圖1 紫花苜蓿幼苗總RNA 電泳圖和cDNA 質(zhì)量評估圖Fig. 1 Electrophoregram of total RNA and quality evaluation of cDNA of alfalfa seedlings

M，marker DL 2 000.

1.5 實時熒光定量PCR

實時定量PCR以紫花苜蓿肌動蛋白基因β-Actin作為內(nèi)參，紫花苜蓿9個鹽響應(yīng)相關(guān)基因為目的基因，采用Premier 5.0進行引物的設(shè)計(表2)，熒光定量PCR用ABI7500實時熒光定量PCR儀完成整個試驗，反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme-ChamQ SYBR qPCR Master Mix)，ROX Reference Dye 2(50 X) 0.4 μL，cDNA 1 μL，終濃度為10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL，dd H2O 7.8 μL。反應(yīng)結(jié)束后，通過檢測溶解曲線來確定PCR產(chǎn)物的特異性，采用Livak和 Schmittgen[15]提出的2-ΔΔct計算基因在不同處理下的相對表達量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003進行數(shù)據(jù)前期處理，用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Origin 8進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 G6PI基因的表達分析

葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucosamine-6-phosphate isomerase，G6PI)是催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸(Fru6P)的可逆相互轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)酶。處理時間和濃度對G6PI基因的表達均有明顯影響(圖2)。NaCl處理1 h時，各濃度下G6PI基因的表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)。0.2% NaCl處理下，G6PI基因的表達量呈先升高后降低再升高的波動性變化；0.4% NaCl處理下，G6PI基因的表達量在4 h 時達到高峰;0.8% NaCl處理下，G6PI基因的表達量顯著高于其他濃度的處理。

2.2 ABP19a基因的表達分析

生長素結(jié)合蛋白(auxin-binding protein，ABP)是廣泛存在于高等植物中的生長素類物質(zhì)，對植物生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用。NaCl處理濃度和時間均對ABP19a的表達量有顯著影響(P<0.05)(圖3)。NaCl處理1 h時，0.4% NaCl脅迫下，ABP19a的表達量先顯著上調(diào)(P<0.05)，然后逐步下降；NaCl處理2 h時，0.4%和0.8% NaCl脅迫的紫花苜蓿中ABP19a的表達量顯著上調(diào)；0.2% NaCl脅迫下，ABP19a的表達量從4 h開始顯著上調(diào)(P<0.05)，8 h時的表達量是其他濃度處理下的6倍。

2.3 Trx-h1基因的表達分析

硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是具有催化活性二硫鍵的小型普遍存在的蛋白質(zhì)。NaCl處理濃度和時間對Trx-h1的表達量都有顯著影響(P<0.05)(圖4)；處理1 h時，除0.2% NaCl脅迫外，其他濃度處理下Trx-h1的表達量均有顯著上調(diào)(P<0.05)，且0.4%NaCl脅迫下上調(diào)幅度更大；0.2% NaCl脅迫下Trx-h1基因的表達量隨時間無顯著變化；0.8% NaCl脅迫下，Trx-h1基因的表達量先顯著上調(diào)，4 h后顯著下調(diào)。

2.4 PR bet 1家族蛋白基因的表達分析

病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins，PR)是植物體在受到真菌、細菌和病毒等病原菌入侵或受到非生物脅迫后產(chǎn)生的一種或幾種上調(diào)蛋白，廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中。如圖5所示，NaCl脅迫1 h時，各濃度處理與對照相比均有顯著性上調(diào)(P<0.05)，0.4% NaCl脅迫下的PRbet1家族蛋白基因的表達量最大，是同一時間點其他濃度處理的4倍；在0.2% NaCl脅迫下，PRbet1家族蛋白基因的表達量在NaCl脅迫處理1 h時表達量最大。

表1 9個鹽響應(yīng)相關(guān)基因的KEGG通路注釋Table 1 KEGG path annotation of nine salt-tolerance genes

2.5 GDPD基因的表達分析

甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphoryl diester phosphodiesterase，GDPD)催化甘油磷酸二酯類物質(zhì)水解為甘油-3-磷酸(G-3-P)和相對應(yīng)的醇類。如圖6所示，NaCl脅迫處理1 h時，3個處理濃度較對照都有顯著性變化(P<0.05)；處理4 h后GDPD基因的表達量均顯著升高；不同濃度處理之間，0.2% NaCl脅迫下GDPD基因的表達量變化最顯著；在時間處理上，4 h是該基因表達量大幅上調(diào)的節(jié)點，8 h該基因表達量都顯著上調(diào)(P<0.05)。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for RT-PCR

圖2 鹽脅迫下G6PI基因的相對表達量Fig. 2 Relative expression of G6PI gene under salt stress

不同大寫字母表示同一處理不同濃度間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一濃度不同處理時間間差異顯著(P<0.05)，下同。

Different capital letters indicate significant difference for the same treatment among different time at the 0.05 level; Different lowercase letters indicate significant difference in expression at different time at the same concentration at the 0.05 level，similarly for the following figures.

2.6 FBPA基因的表達分析

果糖-二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BPA)是生物體內(nèi)碳代謝及糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。NaCl處理濃度和時間對FBPA基因的表達量均有顯著性影響(P<0.05)；0.2% NaCl脅迫下，F(xiàn)BPA的表達量隨時間無顯著變化(P>0.05)；0.4% NaCl脅迫下，F(xiàn)BPA的表達量在2 h最大；0.8% NaCl脅迫下，F(xiàn)BPA的表達量在2 h顯著上調(diào)，在4 h時達到最大，并顯著高于其他處理濃度和處理時間(圖7)。

圖3 鹽脅迫下ABP19a基因的相對表達量Fig. 3 Relative expression of ABP19a under salt stress

圖4 鹽脅迫下Trx-h1基因的相對表達量Fig. 4 Relative expression of Trx-h1 under salt stress

圖5 鹽脅迫下PR bet 1基因的相對表達量Fig. 5 Relative expression of PR bet 1 under salt stress

圖6 鹽脅迫下GDPD基因的相對表達量Fig. 6 Relative expression of GDPD under salt stress

圖7 鹽脅迫下FBPA基因的相對表達量Fig. 7 Relative expression of FBPA under salt stress

2.7 RRM基因的表達分析

RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)，被稱為核糖核蛋白共有序列(RNP-CS)或RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在植物基因表達和調(diào)控中起關(guān)鍵作用。如圖8所示，NaCl處理濃度和時間對RRM基因的表達量都有顯著影響(P<0.05)。0.2% NaCl脅迫下，RRM基因的表達量在脅迫初期有顯著上調(diào)；0.4% NaCl脅迫下，RRM基因的表達量在2 h大幅上調(diào)，4 h表達量達到最大；0.8% NaCl脅迫下，RRM基因的表達量在2 h大幅度上調(diào)，8 h的表達量顯著高于其他處理濃度(P<0.05)。

2.8 6PGDH 基因的表達分析

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH)是戊糖磷酸途徑的一個關(guān)鍵的限速酶。如圖9所示，NaCl濃度和處理時間對6PGDH基因的表達均有顯著影響(P<0.05)；在NaCl脅迫處理1 h時，6PGDH基因的表達量均顯著增加，且0.4%的濃度處理較其他2個濃度表達量更高；而0.8% NaCl脅迫下，PGDH基因的表達量在2 h后顯著上調(diào)，在8 h時最大。

圖8 鹽脅迫下RRM基因的相對表達量Fig. 8 Relative expression of RRM under salt stress

圖9 鹽脅迫下6PGDH基因的相對表達量Fig. 9 Relative expression of 6PGDH under salt stress

2.9 ALDH基因的表達分析

醛脫氫酶(NAD-dependent aldehyde dehydrogenase family protein，ALDH)是一類依賴NAD(P)+的蛋白酶類。如圖10所示，NaCl濃度和處理時間對于ALDH基因的表達均有顯著性影響(P<0.05)；在受到NaCl脅迫時，ALDH的相對表達量在1 h顯著提高，然后逐步下降并在2 h時再次顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖10 鹽脅迫下ALDH基因的相對表達量Fig. 10 Relative expression of ALDH under salt stress

3 討論與結(jié)論

G6PI參與糖酵解、戊糖磷酸、糖異生、糖原合成和葡萄糖醛酸等途徑[16]，并且可以作為響應(yīng)諸如硝酸鹽等環(huán)境因素的刺激的信使[17]。Eunsoo等[18]通過在煙草(Nicotianatabacum)中短暫過量表達芒草葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(G6PI)，增強了煙草中的抗氧化代謝相關(guān)基因的表達，并且在鹽脅迫誘導下G6PI基因表達顯著增加。Cui等[19]發(fā)現(xiàn)，DsGPI基因受鹽度的強烈誘導，且鹽度越高，誘導效果越強，表明DsGPI可能在耐鹽性中起重要作用。本研究中，鹽處理4 h后0.8%和0.4%濃度處理下G6PI基因表達開始下降，0.2%的表達量開始上升，表明高濃度的鹽更能誘導G6PI基因的表達，且不同時間的處理對其也有顯著影響。

生長素結(jié)合蛋白(ABP)通過生長素調(diào)節(jié)過程中的信號轉(zhuǎn)導途徑，參與生長素調(diào)節(jié)的植物生長發(fā)育過程[20]。研究表明，生長素類物質(zhì)可通過促進幼苗快速生長來緩解鹽脅迫[21]。Zolla等[22]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫通過調(diào)控生長素濃度梯度和再分配影響擬南芥的側(cè)根數(shù)、側(cè)根和初生根生長及根的生長方向。在本研究中，鹽處理對ABP19a基因的表達有顯著影響，0.2%和0.4%濃度的鹽處理對于基因表達量的影響更加顯著；鹽脅迫1 h時，0.4%的鹽濃度的脅迫顯著誘導該基因的表達，可能是在受到中濃度的鹽脅迫時，該基因參與生長素的調(diào)節(jié)過程，緩解鹽脅迫。

硫氧還蛋白在植物的抗逆系統(tǒng)中起較重要的作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，OsTRXhl的表達受鹽處理的誘導，在OsTRXhl過表達植株中，鹽處理所引起的細胞質(zhì)外體的活性氧的積累與野生型相比明顯減少，而OsTRXhl的RNAi植株的質(zhì)外體中活性氧含量較多[24]。本研究中，鹽脅迫1 h時，0.4%和0.8%鹽處理下基因的表達量都顯著增加，0.4%鹽脅迫下Trx-h1基因的表達量變化更為顯著，表明該濃度的鹽更能誘導該基因的表達。

PR家族在不同植物中表現(xiàn)為幾丁質(zhì)酶、葡聚糖苷酶、蛋白酶抑制劑、內(nèi)肽酶和過氧化物酶等，在植物自我防御機制中作為可誘導組分發(fā)揮作用[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄(Vitisvinifera)品種Razegui中的RzPR10蛋白受鹽脅迫誘導[27]。本研究中PRbet1基因，在鹽脅迫1堿h時各個鹽脅迫的表達量都有顯著的上調(diào)，0.4%的NaCl處理上調(diào)尤為顯著，表明該基因?qū)χ懈邼舛鹊柠}脅迫更加敏感。

GDPD參與甘油及G-3-P代謝，通過水解甘油磷酸二酯為細胞提供所必需的G-3-P[28-29]。在植物中有關(guān)GDPD及其相關(guān)生理功能的研究報道很少。有研究報道，GDPD-like (glycerophosphodiester phosphodiesterase-like)可能參與了非生物逆境的生理應(yīng)答[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDPD基因與紫花苜蓿的耐鹽性相關(guān)，在鹽脅迫1 h時各濃度處理下該基因的表達量都顯著增加，表明該基因鹽脅迫后期對于耐鹽機制有重要作用，可能是由于GDPD參與甘油和G-3-P代謝相關(guān)。

在植物中，果糖二磷酸醛縮酶參與糖酵解、糖異生以及磷酸戊糖途徑，并在碳代謝、糖代謝等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用[31]。利用芯片雜交技術(shù)對干旱和鹽脅迫條件下的大麥(Hordeumvulgare)轉(zhuǎn)錄水平上的變化研究結(jié)果表明，處理后大麥根中的果糖二磷酸醛縮酶的基因表達量發(fā)生上調(diào)變化[32]；而通過Real-Time PCR方法對TaFBPA基因的表達模式的研究結(jié)果表明，在短期鹽脅迫下，TaFBPA基因發(fā)生明顯的上調(diào)表達[31]。這與本研究中FBPA基因?qū)τ邴}脅迫的響應(yīng)一致，基因的表達量在短期鹽脅迫下顯著上調(diào)，表明在鹽脅迫初期，低鹽更能誘導FBPA基因的表達。

RRM可通過與具有廣泛親和力和序列特異性的RNA結(jié)合，參與RNA代謝，并與多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用[33]，參與植物發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)，有時用作蛋白質(zhì)或RNA分子伴侶[34]。Kwak等[35]研究顯示，ORRM5表達對冷脅迫或鹽脅迫條件有反應(yīng)，但其對鹽處理的反應(yīng)不太顯著。本研究中不同鹽濃度和處理時間顯著影響RRM基因的表達，表明RRM與多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用來參與了鹽脅迫的機制。

6PGDH可調(diào)節(jié)生物代謝產(chǎn)物，抵抗外界環(huán)境破壞，進而通過增強糖代謝途徑提高作物的抗逆性[36]。有研究顯示，蘋果6PGDH受到鹽脅迫不同程度的誘導[37]；也有研究證明，Os6PGDH1的轉(zhuǎn)錄水平受高鹽、低溫、干旱和ABA等非生物脅迫的誘導[38]；本研究結(jié)果顯示，紫花苜蓿中6PGDH受鹽脅迫的顯著誘導，且中高濃度的鹽對于基因的誘導更加顯著，可能是通過提高基因的表達增強糖代謝途徑，產(chǎn)生耐鹽相關(guān)物質(zhì)。

ALDH能夠?qū)⑼庠春蛢?nèi)生的脂肪醛和芳香醛不可逆的氧化為相應(yīng)的羧酸，對提高植物抗干旱、抗鹽堿和清除活性氧等能力具有重要作用[39-40]。有研究表明，過量表達ALDH的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其抗鹽脅迫能力提高，且轉(zhuǎn)基因植株的ROS含量顯著低于野生型，表明醛脫氫酶在細胞代謝和逆境生理方面可能具有重要作用[41-42]。本研究顯示鹽脅迫對于該基因的表達有顯著的誘導，不同濃度NaCl脅迫下紫花苜蓿ALDH基因的表達量都顯著增加，可能是通過基因的表達將體內(nèi)的一些物質(zhì)氧化為相應(yīng)的羧酸，清除活性氧降低其對植物的傷害。

本研究結(jié)果表明，處理時間和處理濃度對9個紫花苜蓿耐鹽相關(guān)基因的表達量均有顯著影響，即使同一個基因在不同強度的鹽脅迫處理中的表達也不相同，這說明在不同鹽脅迫條件下，苜蓿有不同的策略來應(yīng)對鹽脅迫，以保證自身正常的生長和發(fā)育。

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