肉雞大腸桿菌的分離鑒定

文│曹民川 周麗梅 唐振興（陜西省銅川市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

本研究以陜西省銅川市某養(yǎng)殖場疑似肉雞大腸桿菌病的病雞為研究對象，采集其肝臟、脾臟等組織作為病料，進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)以及生化鑒定、血清型鑒定，并進(jìn)一步進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，分離獲取的40株分離株均為大腸桿菌，分離率為66.67%，其血清型分別為O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：分離株對環(huán)丙沙星高敏；對卡那霉素、紅霉素中敏；對青霉素、鏈霉素、慶大霉素低敏。因此，環(huán)丙沙星可以作為該養(yǎng)雞場預(yù)防和治療雞大腸桿菌病的藥物，其他抗生素可以減少其使用量或停用。

當(dāng)機(jī)體的抵抗力下降或者外界的環(huán)境發(fā)生改變有一部分大腸桿菌成為致病菌株，達(dá)到了致病性大腸桿菌生長發(fā)育的條件，大腸桿菌數(shù)量增多，就會(huì)乘虛而入侵入動(dòng)物腸道內(nèi)并在合適的位置定居，生長繁殖。臨床上以出現(xiàn)心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、眼球炎及肉芽腫、敗血癥等為特征。大腸桿菌可以通過飼料、水、空氣等進(jìn)行傳播，也可以垂直傳播但容易造成死胚、弱雛增多，使養(yǎng)禽業(yè)受到打擊。大腸桿菌病是養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的常見多發(fā)病，尤其是3～6周齡的雛雞容易感染，且在臨床中多以混合感染，從而難以治愈，發(fā)病率高，死亡率逐步增加。該病的傳染性強(qiáng)，傳播范圍廣，因?yàn)榇竽c桿菌的血清型比較復(fù)雜，目前沒有有效的疫苗可以預(yù)防。因此，該病一直以來主要用藥物來進(jìn)行防治，這使得耐藥性越來越嚴(yán)重，給治療帶來一定的難度。

大腸桿菌生長的環(huán)境簡單，營養(yǎng)的要求低，在一般的營養(yǎng)培養(yǎng)基上即可成長，溫度在15～45℃，菌落直徑2～3毫米，圓形，表面濕潤光滑。該菌對理化要素較敏感，60℃25分鐘或55℃1小時(shí)即可致死，121℃經(jīng)高壓滅菌迅速死亡。該菌對自然因素抵抗力較強(qiáng)，可在水中生存百余天，在糞便中能生存200多天，在飼料、墊草，中也可長期生存。大腸桿菌對甲醛、漂白粉敏感，但是如果存在糞便以及黏液，會(huì)很大一部分降低這些消毒劑的成效。多數(shù)禽類對大腸桿菌較為敏感，并且在感染后病情會(huì)加重，雛雞極易發(fā)生氣囊炎。感染大腸桿菌的肉雞表現(xiàn)精神萎靡，體溫呈上升趨勢，食欲減少，消瘦和下痢，全身無力，羽毛變得疏松，呆立，伸頸閉眼，行動(dòng)緩慢，其中糞便里混有少量黏液，經(jīng)常導(dǎo)致肛門周圍的羽毛受到污染。情況嚴(yán)重的病雞腹部出現(xiàn)高度腫大，觸摸敏感并伴有波動(dòng)，病程能夠持續(xù)兩個(gè)星期或更長。

治療大腸桿菌病首先應(yīng)該改善飼養(yǎng)環(huán)境，及時(shí)清除雞糞，提高室溫，改善雞舍通風(fēng)的狀況，利用百毒殺每天帶雞噴霧消毒2次，連續(xù)使用7天?？墒褂昧蛩峥敲顾?，按70毫克/千克體重的用量，2次/日，肌肉注射，連續(xù)使用3天，用藥2天后雞群采食量增加，癥狀開始出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，5天后雞群開始恢復(fù)正常。

本研究對疑似肉雞大腸桿菌病的病雞采集其肝臟、脾臟作為病料，進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、血清型鑒定、藥敏試驗(yàn)，為臨床治療肉雞大腸桿菌病提供了參考。

一、材料與方法

1.材料。

（1）病料。取自銅川市某養(yǎng)殖場中疑似患有大腸桿菌病的病雞，60只，3～6周齡。

（2）培養(yǎng)基。肉湯培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基。

（3）標(biāo)準(zhǔn)O型分型血清。單因子大腸桿菌血清（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

（4）主要儀器和設(shè)備。恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、高壓蒸汽滅菌鍋（山東新華醫(yī)療機(jī)械有限公司）、光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯、濟(jì)南）。

2.方法。

（1）臨床檢查。觀察病雞的精神狀態(tài)、飲欲、食欲和雞的羽毛色澤，用手觸摸，給予適當(dāng)?shù)拇碳び^察雞的反應(yīng)。觀察病雞產(chǎn)蛋的情況、排泄物的黏稠程度，糞便顏色，有沒有惡臭，并且查閱最近兩周內(nèi)雞群的采食量的記錄。

（2）剖檢。首先仔細(xì)觀察病雞的表面狀況，包括雞冠和皮膚、鼻腔和嘴的分泌物及排泄物的性狀、顏色，然后打開胸腔、腹腔，觀察有無積液，觀察黏膜、氣囊的變化，各內(nèi)臟器官有無出血等病變，并無菌采集病死雞的肝臟、脾臟作為病料。

（3）病原菌的分離培養(yǎng)與純化。在無菌條件下取病雞的肝組織，脾臟組織等接種于肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)23～24小時(shí)，觀察結(jié)果。

（4）生化試驗(yàn)。選取麥康凱培養(yǎng)基上單一紅色菌落于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)17小時(shí)后，取適量的菌液，分別接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘露醇、山梨醇、硫化氫、肌醇、尿素、V.P試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察結(jié)果。

（5）血清型鑒定?？乖闹苽?。制備高壓抗原：在普通的瓊脂斜面平板上以及供大腸桿菌生長的肉湯小管里接種來自麥康凱培養(yǎng)基上接種被檢的菌株，其中被檢菌株放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時(shí)，在麥康凱培養(yǎng)基上形成典型的、單個(gè)的小紅色菌落，進(jìn)行分別接種，接種后在37℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，其中普通肉湯小管為液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)期間需要震蕩。然后用約3毫升的0.5%石碳酸生理鹽水沖洗瓊脂斜面培養(yǎng)物，放置試管中，并與普通肉湯小管培養(yǎng)物一起放到121℃高壓中2小時(shí)，破壞K抗原。

玻板凝集反應(yīng)。將高壓抗原和血清分別取8毫升放到玻板上混合均勻，在2～4分鐘內(nèi)呈現(xiàn)明顯的凝集則為陽性反應(yīng)。

（6）藥敏試驗(yàn)。打開超凈工作臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈上來回灼燒進(jìn)行滅菌，然后挑取細(xì)菌培養(yǎng)物，將菌液均勻的涂布到平皿中。然后用無菌的鑷子夾起藥敏紙片放到固體培養(yǎng)基上面并輕輕按壓，使藥敏紙片與培養(yǎng)基表面全部接觸。為了能夠精確察看結(jié)果，藥敏紙片位置安放適中，避免出現(xiàn)抑菌圈重疊。20分鐘后再置于37℃溫箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察結(jié)果。

二、結(jié)果

1.臨床檢查結(jié)果。病雞精神萎靡，咳嗽，呼吸困難，羽毛疏松，飲欲變大，食欲減小，用手觸摸，能感受到病雞畏寒發(fā)抖，給予適當(dāng)?shù)拇碳?，病雞反應(yīng)停滯；產(chǎn)蛋率下降，蛋小、蛋殼粗糙；排黃綠色的稀糞，有酸臭味。

表1 分離細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

◎圖1 分離菌菌落形態(tài)（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）

◎圖2 分離菌菌落形態(tài)（麥康凱培養(yǎng)基）

2.剖檢變化。病雞的雞冠出現(xiàn)暗紫色，皮膚外表顏色暗淡、無光澤，鼻分泌物增加；解剖病雞可見腹腔內(nèi)有大量的腹水；直腸腸管的黏膜以及泄殖腔黏膜呈現(xiàn)彌漫性的針尖狀出血，氣囊變厚，出現(xiàn)混濁；肝臟變得腫大，外表籠罩一層點(diǎn)狀黃白色纖維性膜，表面有大小不等的壞死斑。

表2 40株分離菌血清型鑒定結(jié)果

表3 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3.病原菌的分離與純化。待分離菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長24小時(shí)后，形成乳白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上形成紅色菌落，如圖1、圖2。分離菌經(jīng)過涂片、染色、鏡檢，形成革蘭染色陰性短粗桿菌無可見的莢膜，具有典型的大腸桿菌的染色特及形態(tài)，如圖3。

4.生化試驗(yàn)結(jié)果。從分離培養(yǎng)的細(xì)菌中，挑取典型的菌落，使用馬丁湯培養(yǎng)，用常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

5.血清型鑒定結(jié)果。對銅川市某養(yǎng)殖場送檢的60份病料，經(jīng)鑒別分離出40株肉雞源大腸桿菌菌株，分離率為66.67 %。其中40株肉雞源大腸桿菌中有33株鑒定出O血清型，占分離菌株的82.50 %；7株未定型，占分離菌株的17.50%。鑒定出的33株大腸桿菌O血清型分別為O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株），其中主要的血清型為O78、O2、O8三種，占分離菌株總數(shù)的72.73 %，結(jié)果見表2。

6.藥敏試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星對大腸桿菌的敏感性較高；卡那霉素、紅霉素對大腸桿菌的敏感性一般；青霉素、鏈霉素、慶大霉素對大腸桿菌的敏感性較低；說明環(huán)丙沙星作為治療該病首選藥物。具體結(jié)果見表3。

三、討論

本研究通過對銅川市的40株肉雞源致病性大腸桿菌分離菌株的血清型鑒定結(jié)果可以知道O78、O2、O8等菌株出現(xiàn)的頻率很高，這與國內(nèi)外研究報(bào)道的O78和O35禽致病性大腸桿菌常見血清型基本相符。

本研究分離鑒定出40株肉雞源大腸桿菌菌株，分離率為66.67%，分離率較高，表明大腸桿菌病在該地區(qū)發(fā)生頻繁，是養(yǎng)殖業(yè)中常見病之一。通過分析我們可以知道，該病的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如飼養(yǎng)管理不當(dāng)、營養(yǎng)失衡、疫苗接種所產(chǎn)生的應(yīng)激、天氣惡劣或繼發(fā)于其他的疾病等。該病多以混合感染的形式出現(xiàn)，大腸桿菌病產(chǎn)生的概率也越來越高，治療也越來越困難，目前大腸桿菌病已居于細(xì)菌性疾病之首?，F(xiàn)在，如果只是單一防治大腸桿菌病已經(jīng)難以收到理想的效果，與此同時(shí)應(yīng)該消除其他可能性的致病因素。在已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性的雞場尤其是高發(fā)地區(qū)，最好能進(jìn)行大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)，篩選出高敏藥物，制訂出合理的給藥計(jì)劃，配合環(huán)境消毒，改善飼養(yǎng)管理的條件，從而達(dá)到理想的治療效果。

目前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展速度非常快，細(xì)菌的耐藥性問題也越來越受到人們的關(guān)注。林居純等2009年對來自我國不同地區(qū)的588株大腸桿菌進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果顯示禽源大腸桿菌的多重耐藥性現(xiàn)象非常嚴(yán)重，禽源菌株占95.12%。

◎圖3 分離菌在顯微鏡下的形態(tài)（×100）

隨著大腸桿菌耐藥菌株不斷增加，肉雞大腸桿菌病的有效防治也越來越難，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展。細(xì)菌的耐藥性是可以通過質(zhì)粒的接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，威脅人類的身體健康。因此，我們需要尋找有效、能夠延緩和減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的治療方法。首先，我們應(yīng)該學(xué)會(huì)科學(xué)適當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖、防止過度濫用藥物；條件好的養(yǎng)殖場應(yīng)該通過藥敏試驗(yàn)來選擇用藥；優(yōu)化飼養(yǎng)管理的方式，減少大腸桿菌病的發(fā)生。