草蓯蓉多糖對(duì)氧化應(yīng)激所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用

崔香丹，何 鑫，朱潔波，劉莉園，全吉淑,*，尹學(xué)哲,*

血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管內(nèi)壁表面的單層扁平或多角形的細(xì)胞，組成血管第1道屏障，可分泌血管活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血流、參與物質(zhì)交換、調(diào)節(jié)血壓、抑制血小板聚集及血栓形成等功能，其損傷是引起高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素[1-2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷多與氧化應(yīng)激有關(guān)，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷和功能障礙[1-2]。引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素有多種，如過(guò)氧化氫、氧化低密度脂蛋白、末端晚期糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ、細(xì)菌脂多糖、腫瘤壞死因子-α等[1-2]。過(guò)氧化氫是目前應(yīng)用最為廣泛的氧化應(yīng)激損傷劑之一，易透過(guò)細(xì)胞膜，可誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[1-4]。叔丁基過(guò)氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，tBHP）是近年來(lái)常用的穩(wěn)定的氧化應(yīng)激損傷劑，損傷機(jī)制基本與過(guò)氧化氫相同，但具有穩(wěn)定、不易分解的優(yōu)勢(shì)[1,5]。故本研究采用tBHP損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞制備其氧化應(yīng)激損傷模型。

草蓯蓉（Boschniakia rossica Fedtsch. et Flerov.）為列當(dāng)科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，具有延年益壽、滋補(bǔ)強(qiáng)身、補(bǔ)腎壯陽(yáng)以及潤(rùn)腸止血等功效[5-8]。近年來(lái)的研究表明，草蓯蓉具有抗氧化、抗炎、保肝及抗癌等作用[6-8]。草蓯蓉多糖（Boschniakia rossica polysaccharides，BRPS）是草蓯蓉的重要活性成分[9-12]，無(wú)毒且具有抗高脂血癥和免疫增強(qiáng)等功能[9-10]，提示其在抗動(dòng)脈硬化方面的應(yīng)用潛能。本課題組新近研究還發(fā)現(xiàn)，BRPS對(duì)氧化應(yīng)激所致肝細(xì)胞氧化損傷及凋亡具有抑制作用[11-12]，鑒于其較強(qiáng)的抗氧化作用以及抗肝細(xì)胞氧化應(yīng)激能力，推測(cè)BRPS可能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷也有保護(hù)作用。但目前為止，BRPS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究采用tBHP誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，探討B(tài)RPS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷以及凋亡的抑制作用，旨在為草蓯蓉的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC） 南京凱基生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基 以色列Bioind公司；胎牛血清 美國(guó)Gemini公司；四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶、小鼠β-actin抗體、兔抗小鼠二抗、羊抗兔二抗美國(guó)Sigma-Aldrich公司；丙二醛（malondialdelyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測(cè)試盒 南京建成科技有限公司；Hoechst33342、ROS測(cè)試盒、JC-1線(xiàn)粒體跨膜電位（mitochondrial membrane potentials，ΔΨm）測(cè)試盒、原位末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡測(cè)試盒、細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒、細(xì)胞線(xiàn)粒體分離試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；兔Bcl-2抗體、兔Bax抗體、兔細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）抗體、小鼠Bid抗體、兔Caspase-3抗體、兔Caspase-3抗體、兔Caspase-8抗體、兔Caspase-9抗體、兔Cyt c氧化酶IV（Cyt c oxidase IV，Cox4）抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Shel Lab公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；酶標(biāo)儀 深圳雷杜公司；迷你垂直板電泳儀、迷你轉(zhuǎn)印槽 美國(guó)Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng) 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BRPS的提取及活性成分測(cè)定

BRPS采用常規(guī)醇沉法提取，用Sevag法除蛋白質(zhì)[13]。用苯酚-硫酸法[14]測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.5%。

1.3.2 BRPS對(duì)HUVEC毒性的測(cè)定

細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)及傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板，使細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL。待細(xì)胞完全貼壁后，換入含BRPS的無(wú)血清培養(yǎng)液使其質(zhì)量濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L。24 h后，MTT法測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的OD值，并根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率[5]。以細(xì)胞存活率大于等于90%為標(biāo)準(zhǔn)確定BRPS安全劑量[15]。

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201809020

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.2；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-6630（2018）09-0127-07

引文格式：崔香丹, 何鑫, 朱潔波, 等. 草蓯蓉多糖對(duì)氧化應(yīng)激所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(9):127-133. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201809020. http://www.spkx.net.cn

CUI Xiangdan, HE Xin, ZHU Jiebo, et al. Inhibition of Boschniakia rossica polysaccharides on oxidative stress-induced apoptosis in vascular endothelial cells[J]. Food Science, 2018, 39(9): 127-133. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201809020. http://www.spkx.net.cn

1.3.3 BRPS對(duì)tBHP損傷HUVEC存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板，貼壁后換入BRPS無(wú)血清培養(yǎng)液使BRPS質(zhì)量濃度分別為100、50、25 mg/L，依次記為BRPS100組、BRPS50組和BRPS25組（BRPS高、中和低劑量組）。培養(yǎng)24 h后，損傷組和BRPS各劑量組加tBHP溶液使其質(zhì)量濃度為200 μmol/L，損傷12 h，正常組細(xì)胞則換入正常培養(yǎng)液。用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。

1.3.4 細(xì)胞ROS水平的檢測(cè)

采用二氯熒光素乙酰乙酸鹽（dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）法檢測(cè)[16]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔板爬片內(nèi)，細(xì)胞分組及處理同上。細(xì)胞固定后，換入DCFH-DA無(wú)血清培養(yǎng)液，避光孵育20 min。封片后在熒光顯微鏡下觀(guān)察，并用Image J軟件進(jìn)行自動(dòng)熒光定量分析。ROS作用下生成的二氯熒光素（dichlorofluorescein，DCF）可產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光，根據(jù)其熒光強(qiáng)度可衡量細(xì)胞內(nèi)ROS水平[16]。

1.3.5 細(xì)胞MDA、GSH水平和SOD活力的檢測(cè)

將細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞分組和損傷處理同上。收集并裂解細(xì)胞，離心取上清液。按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定細(xì)胞MDA、GSH含量和SOD活力。

1.3.6 ΔΨm的檢測(cè)

細(xì)胞線(xiàn)粒體跨膜電位（mitochondrial membrane potentials，ΔΨm）采用JC-1染色法檢測(cè)[17]。細(xì)胞分組及處理、制作爬片和固定方法同上。細(xì)胞固定后，換入JC-1染色工作液，避光孵育20 min。封片后在熒光顯微鏡下觀(guān)察。ΔΨm高時(shí)，JC-1可形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；ΔΨm較低時(shí)，JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光，可根據(jù)紅、綠色熒光比值衡量ΔΨm水平[17]。

1.3.7 Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用Hoechst33342染色法檢測(cè)[18]。分組及處理、制作爬片和固定方法同上。細(xì)胞固定后，換入Hoechst33342染色液，封片后在熒光顯微鏡下觀(guān)察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，因細(xì)胞膜通透性升高，Hoechst33342染色液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與已受損的DNA結(jié)合發(fā)出強(qiáng)藍(lán)色熒光，而正常細(xì)胞則發(fā)出均勻彌散的弱熒光，可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征及熒光強(qiáng)度可綜合評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡水平[18]。

1.3.8 TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

TUNEL染色技術(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)[19]。分組及處理同上。制作爬片和固定細(xì)胞，換入TUNEL檢測(cè)液，避光孵育60 min。封片后在熒光顯微鏡下觀(guān)察[19]，并用Image J軟件進(jìn)行自動(dòng)熒光定量分析。

1.3.9 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cyt c、tBid、Caspase蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞分組和損傷處理同上。收集細(xì)胞，提取總蛋白、胞漿蛋白和線(xiàn)粒體蛋白。依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗及二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法顯色后進(jìn)行灰度分析[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以 ±s表示。利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BRPS對(duì)HUVEC的毒性

圖1 BRPS對(duì)HUVEC的毒性Fig. 1 Cell toxicity of BRPS on HUVEC

研究表明，BRPS高質(zhì)量濃度時(shí)具有一定的細(xì)胞毒性[11-12]。因此，首先用MTT法檢測(cè)單純BRPS對(duì)HUVEC存活率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。BRPS質(zhì)量濃度小于等于100 mg/L時(shí)，HUVEC存活率均大于90%，與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不顯示細(xì)胞毒性。因此，本研究選取100、50、25 mg/L作為BRPS干預(yù)劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 BRPS對(duì)tBHP損傷HUVEC存活率的影響

圖2 BRPS對(duì)tBHP損傷HUVEC存活率的影響Fig. 2 Effect of BRPS on viability of HUVEC injured by tBHP

tBHP是氧化應(yīng)激損傷劑，可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)自由基生成，并引發(fā)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[2,16]。由圖2可知，與正常組比較，tBHP損傷組HUVEC存活率顯著降低（P＜0.05），為（49.4±4.1）%；而B(niǎo)RPS高、中和低劑量組HUVEC存活率分別為（71.3±11.2）%、（60.8±7.3）%和（54.3±3.2）%，與損傷組比較升高44.3%、23.1%和9.9%，差異顯著（P＜0.05）。提示BRPS預(yù)處理能抑制tBHP所致HUVEC氧化應(yīng)激損傷。

2.3 BRPS對(duì)tBHP損傷HUVEC ROS水平的影響

tBHP是氧化應(yīng)激損傷劑，氧化應(yīng)激所致ROS在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量蓄積是引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要原因[2]。熒光探針DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，但在細(xì)胞內(nèi)可水解成DCFH，繼而被過(guò)量ROS氧化生成DCF并發(fā)出綠色熒光[16]。

圖3 BRPS對(duì)tBHP誘導(dǎo)的ROS生成的影響Fig. 3 Effect of BRPS on tBHP-induced ROS formation in HUVEC

如圖3所示，與正常組比較，損傷組細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光，熒光強(qiáng)度增高44 倍，提示細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；而B(niǎo)RPS高、中和低劑量組細(xì)胞則產(chǎn)生微弱綠色熒光，與損傷組比較熒光強(qiáng)度分別下降93.1%、82.2%和64.6%，差異顯著（P＜0.05）；且隨BRPS質(zhì)量濃度的升高，熒光強(qiáng)度呈減弱趨勢(shì)；提示BRPS預(yù)處理降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.4 BRPS對(duì)HUVEC MDA、GSH、SOD水平的影響

氧化應(yīng)激主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)自由基生成增多及抗氧化防御體系破壞；打破機(jī)體的氧化與抗氧化平衡，機(jī)體便會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[20-21]。SOD等抗氧化酶及GSH等抗氧化劑可共同形成細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御體系，有效對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷[20-21]。

由表1可見(jiàn)，與正常組比較，損傷組內(nèi)皮細(xì)胞SOD活力和GSH含量顯著降低（P＜0.05），MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS組內(nèi)皮細(xì)胞SOD活力與GSH含量顯著升高（P＜0.05），MDA水平顯著降低（P＜0.05），提示BRPS預(yù)處理可上調(diào)HUVEC抗氧化防御能力。

表1 BRPS對(duì)HUVEC SOD活力、GSH和MDA含量的影響（n＝ 6）Table 1 Effect of BRPS on SOD activity, and GSH and MDA contents of HUVEC (n= 6)

2.5 BRPS對(duì)HUVEC ΔΨm的影響

線(xiàn)粒體是氧化磷酸化進(jìn)行的場(chǎng)所，也是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所[3,17]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)積累過(guò)量ROS時(shí)，線(xiàn)粒體膜結(jié)構(gòu)受損，線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換通道繼而開(kāi)放，導(dǎo)致ΔΨm下降[3,17]。而這種ΔΨm的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最早發(fā)生的事件[22]。JC-1是檢測(cè)ΔΨm的熒光探針，ΔΨm較高時(shí)，在線(xiàn)粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；ΔΨm較低時(shí)，不能形成聚合物而形成單體，產(chǎn)生綠色熒光[17]。

圖4 BRPS對(duì)HUVEC ΔΨm水平的影響Fig. 4 Effect of BRPS on ΔΨm of HUVEC

如圖4所示，與正常組比較，損傷組內(nèi)皮細(xì)胞ΔΨm降低；與損傷組比較，BRPS組細(xì)胞ΔΨm增高，隨BRPS劑量的升高，紅色熒光呈增強(qiáng)趨勢(shì)；綠色熒光呈減弱趨勢(shì)；提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC ΔΨm的下降。

2.6 HUVEC Hoechst33342染色結(jié)果

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及繼發(fā)的細(xì)胞凋亡是心血管疾病發(fā)生的核心事件[23]。Hoechst33342是可穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，可用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。它使正常細(xì)胞發(fā)出較弱藍(lán)色熒光，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，染色液大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，加上細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)受損，結(jié)合增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度變強(qiáng)[18]。

圖5 HUVEC Hoechst33342染色結(jié)果Fig. 5 Hoechst33342 staining of HUVEC

由圖5可見(jiàn)，正常組細(xì)胞藍(lán)色熒光弱，染色均勻彌散，細(xì)胞數(shù)量較多。損傷組細(xì)胞熒光強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見(jiàn)細(xì)胞核發(fā)生固縮、核內(nèi)呈顆粒狀明亮藍(lán)色熒光，出現(xiàn)明顯凋亡特征。BRPS組細(xì)胞核內(nèi)顆粒狀明亮藍(lán)色熒光呈逐漸減弱趨勢(shì)，大部分細(xì)胞藍(lán)色熒光均勻彌散，接近正常組細(xì)胞特征。

2.7 BRPS對(duì)HUVEC凋亡的影響

細(xì)胞凋亡具有特定的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)變化特征，常用的檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)檢測(cè)、DNA片段化、線(xiàn)粒體膜電位、TUNEL法等，而TUNEL染色技術(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)[19]。

圖6 BRPS對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響Fig. 6 Effect of BRPS on tBHP-induced apoptosis in HUVEC

如圖6所示，正常組幾乎看不到凋亡細(xì)胞；損傷組部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮等早期凋亡特征，與正常組比較，凋亡細(xì)胞明顯增多；與損傷組比較，BRPS組凋亡細(xì)胞明顯減少，BRPS高、中和低劑量組熒光強(qiáng)度分別下降59.1%、46.9%和32.5%，差異顯著（P＜0.05）；且隨BRPS劑量的升高呈遞減趨勢(shì)。提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC凋亡。

2.8 BRPS對(duì)HUVEC Caspase活化的影響

細(xì)胞凋亡主要有線(xiàn)粒體凋亡途徑、死亡受體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，而Caspase活化是細(xì)胞凋亡的典型生物化學(xué)特征，前二者分別以Caspase9和Caspase8為該途徑的關(guān)鍵酶，激活下游的凋亡執(zhí)行者Caspase3，完成凋亡通路的最后共同環(huán)節(jié)[24-25]。

圖7 BRPS對(duì)HUVEC Caspase活化片段表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of BRPS on the expression of active caspase subunits in HUVEC

由圖7可見(jiàn)，與正常組比較，損傷組細(xì)胞Caspase活化片段Cleaved caspase3（Cleaved c3）、Cleaved caspase8（Cleaved c8）和Cleaved caspase9（Cleaved c9）表達(dá)顯著升高（P＜0.05），分別為正常組的2.8、2.1 倍和3.0 倍；與損傷組比較，BRPS組細(xì)胞Caspase活化片段Cleaved c3、Cleaved c8、Cleaved c9表達(dá)顯著降低（P＜0.05），其中BRPS高劑量組中各活化片段的表達(dá)分別下降70.6%、45.9%和47.2%，提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC Caspase的活化，從而抑制HUVEC凋亡。

2.9 BRPS對(duì)HUVEC胞漿Cyt c蛋白表達(dá)的影響

線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡中處于核心地位[3]。線(xiàn)粒體膜通透性的改變以及ΔΨm的下降使Cyt c從線(xiàn)粒體釋放至胞漿中，激活Caspase9及其下游的Caspase-3，從而誘導(dǎo)Caspase依賴(lài)性的經(jīng)典線(xiàn)粒體凋亡途徑[3,26]。

圖8 BRPS對(duì)HUVEC胞漿Cyt c水平的影響Fig. 8 Effect of BRPS on cytoplasmic Cyt c in HUVEC

如圖8所示，與正常組比較，損傷組HUVEC胞漿Cyt c蛋白水平顯著升高（P＜0.05），為正常組的5.4 倍；與損傷組比較，BRPS組HUVEC胞漿Cyt c蛋白水平顯著下降（P＜0.05），BRPS高、中和低劑量組中分別下降71.4%、69.4%和22.4%；提示BRPS減少tBHP所致HUVEC線(xiàn)粒體Cyt c的釋放，抑制Caspase依賴(lài)的HUVEC凋亡。

2.1 0 BRPS對(duì)HUVEC Bcl-2、Bax和Bid蛋白表達(dá)的影響

Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，按功能可分為抗凋亡和促凋亡蛋白，后者又分成多結(jié)構(gòu)域蛋白和只有BH3結(jié)構(gòu)蛋白，代表性成員分別有Bax和Bid等[18,27]?？沟蛲龀蓡T，如Bcl-2，可保護(hù)線(xiàn)粒體完整性，阻止Cyt c釋放以及隨后的Caspase9活化，因此，抗凋亡成員和促凋亡成員之間平衡決定著細(xì)胞存亡，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[18,28]。Bid蛋白可介導(dǎo)死亡受體凋亡途徑，經(jīng)Caspase8切割形成有活性的Bid截短片段（truncated Bid，tBid），轉(zhuǎn)移至線(xiàn)粒體上，促進(jìn)Cyt c的釋放，從而導(dǎo)致Caspase9和Caspase3的激活[29]。

圖9 BRPS對(duì)HUVEC Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Fig. 9 Effect of BRPS on the expression of Bcl-2 and Bax proteins in HUVEC

圖10 BRPS對(duì)HUVEC線(xiàn)粒體tBid水平的影響Fig. 10 Effect of BRPS on mitochondrial tBid of HUVEC

如圖9、10所示，與正常組比較，損傷組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)上調(diào)1.5 倍，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)0.5 倍，Bax/Bcl-2比值升高2.8 倍，線(xiàn)粒體tBid水平升高1.1 倍，差異均顯著（P＜0.05）；與損傷組比較，BRPS高、中和低劑量組細(xì)胞Bax相對(duì)表達(dá)量分別降低57.1%、44.3%和19.0%，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量分別升高136.4%、27.3%和9.1%，Bax/Bcl-2比值分別下降81.9%、56.3%和25.8%，線(xiàn)粒體tBid水平分別下降45.5%、44.5%和36.4%，差異顯著（P＜0.05），提示BRPS可通過(guò)阻止Bid活化以及降低Bax/Bcl-2比值而抑制HUVEC凋亡。

3 討 論

氧化應(yīng)激是常見(jiàn)的應(yīng)激損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)生成過(guò)量ROS，并造成細(xì)胞損傷和死亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感，過(guò)量ROS可使內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生變性損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損和功

能喪失[1]。tBHP是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，以tBHP為損傷劑構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型已非常普遍和成熟[30-32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，tBHP對(duì)HUVEC顯示細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低，ROS生成水平升高，抗氧化防御能力下降，線(xiàn)粒體Cyt c的釋放增多，ΔΨm下降，細(xì)胞凋亡增多。提示tBHP引發(fā)HUVEC氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致HUVEC凋亡，這與前人報(bào)道相吻合[30-32]。本研究結(jié)果顯示，BRPS預(yù)處理能增高HUVEC存活率，降低細(xì)胞ROS水平，增強(qiáng)抗氧化防御能力，升高ΔΨm水平，抑制細(xì)胞凋亡，提示BRPS能改善tBHP誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡。從分子水平發(fā)現(xiàn)，BRPS下調(diào)HUVEC線(xiàn)粒體Cyt c的釋放，下調(diào)線(xiàn)粒體tBid水平，降低Bax/Bcl-2比值，抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Caspase-9的激活由線(xiàn)粒體凋亡途徑介導(dǎo)，而Caspase-8的激活和Bid的切割需要死亡受體的介導(dǎo)[26-29]。因此，BRPS對(duì)HUVEC凋亡的抑制作用可能與線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑均有關(guān)。綜上所述，BRPS可清除HUVEC內(nèi)自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制氧化應(yīng)激所致HUVEC凋亡，對(duì)心血管疾病的防治起到積極作用。本研究為草蓯蓉的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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