針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能及缺血半暗區(qū)皮層細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響①

葉濤，朱路文，阮野，李宏玉，吳孝軍，陳玉宏，趙一點(diǎn)，田源，唐強(qiáng)

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

腦卒中是中國人的主要死亡原因，也是全球成年人永久性殘疾的最常見原因，其中缺血性腦卒中約占所有病例的80%，治療方案有限[1]。針康法是腦卒中康復(fù)的一種新策略[2]，即在頭穴叢刺長留針期間同步進(jìn)行各種康復(fù)訓(xùn)練，強(qiáng)調(diào)“針康同步、動態(tài)治療、整體康復(fù)”的治療理念，能顯著改善腦卒中患者運(yùn)動障礙、平衡障礙、言語障礙及吞咽障礙等，提高日常生活活動能力，總有效率達(dá)94.67%，優(yōu)于單一針刺、康復(fù)訓(xùn)練。既往我們從腦缺血后神經(jīng)再生、血管新生、軸突再生、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多個方面對針康法的腦保護(hù)作用進(jìn)行探討，為針康法的臨床推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)[2-9]。

腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的caspase家族“瀑布式”次序激活，與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。本課題組研究證實(shí)，針康法的抗凋亡機(jī)制與促進(jìn)缺血半暗區(qū)X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)表達(dá)、抑制caspase-9蛋白活化有關(guān)[4]。

在caspase級聯(lián)反應(yīng)中，caspase-8和caspase-3分別為起始者與執(zhí)行者的核心，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟及凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路[10-11]；細(xì)胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis 1,cIAP1)能直接抑制caspase家族成員，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)傳導(dǎo)通路，具有廣泛的抗凋亡活性[12-13]。

本研究觀察針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能及cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3和cIAP1表達(dá)的影響，探討針康法腦保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組

SPF級Sprague-Dawley大鼠，雄性，10～12周齡，初始體質(zhì)量240～260 g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(遼)2015-0001。

大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心SPF級屏障環(huán)境。人工光照12 h∶12 h明暗交替，室溫(24±1)℃，濕度(65±10)%，噪音＜60 dB，通風(fēng)良好，自由食水。

實(shí)驗前，大鼠適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，速度15 m/min，每天15 min，共3 d，篩選愿意跑臺訓(xùn)練的大鼠90只。

本實(shí)驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗管理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗大鼠的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗動物的指導(dǎo)性意見》。

隨機(jī)數(shù)字表法[4]將90只大鼠分入假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組，每組18只，再分成3d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。

造模失敗或?qū)嶒炛兴劳?，另選大鼠補(bǔ)充。

1.2 主要儀器和試劑

ZH-PT型動物實(shí)驗跑臺：徐州利華電子科技發(fā)展有限公司。R03-1型大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀：上海欣軟信息科技有限公司。ELX-800型酶標(biāo)儀：美國BIOTEK公司。WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)、WD-9405B型水平搖床、DY-CZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀、DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽：北京六一生物科技有限公司。一次性無菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。

cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3多克隆抗體：美國CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。cIAP1多克隆抗體：美國SANTA CRUZ公司。PVDF膜：美國MILLIPORE公司。預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)：加拿大FERMENTAS公司。TEMED：美國AMRESCO公司。驢抗山羊IgG-HRP：上海碧云天生物技術(shù)公司。內(nèi)參抗體β-actin、羊抗兔IgG-HRP、ECL發(fā)光液：沈陽萬類生物科技有限公司。

1.3 造模及入組

參考前期實(shí)驗研究[6]，改良Koizumi線栓法[14]制備大鼠永久性大腦中動脈閉塞腦缺血模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，不禁水。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。于(37±1)℃恒溫手術(shù)臺上固定大鼠，頸部術(shù)區(qū)備皮、消毒，鈍性剝離皮下組織，暴露右側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，依序結(jié)扎頸總動脈近心端、頸外動脈遠(yuǎn)心端，頸總動脈主干下方備活結(jié)。微動脈夾阻閉分叉處血流，距分叉處5 mm開一個“V”形口，將3 cm線栓(前端2～3 mm石蠟包埋處理)由此口插入；松開微動脈夾，線栓沿頸內(nèi)動脈進(jìn)入，達(dá)大腦中動脈分支起始處，固定頸總動脈上的活結(jié)。常規(guī)消毒、縫合，白熾燈照射維持肛溫(37±1)℃至蘇醒。

假手術(shù)組不插入魚線，其余操作相同。

術(shù)后24 h行Longa評分，1～3分大鼠納入實(shí)驗。

1.4 干預(yù)方法

術(shù)后24 h，針刺組予頭穴叢刺治療。定位大鼠百會穴及其左右旁開2 mm處，采用直徑0.25 mm、長25 mm針灸針叢刺，快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h，每天1次。

康復(fù)組予循序漸進(jìn)電動跑臺訓(xùn)練。坡度0°，速度前3 d 8 m/min，4～7 d 12 m/min，7 d后15 m/min，每次30 min，每天1次。

針康組予頭穴叢刺，在長留針期間，行跑臺訓(xùn)練。針刺和跑臺方案同針刺組和康復(fù)組。

假手術(shù)組和模型組術(shù)后同等條件抓取，不進(jìn)行任何治療。

1.5 神經(jīng)功能評定

1.5.1 改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[6]

各亞組采用mNSS，從運(yùn)動、感覺、橫梁平衡與反射缺損和異常活動四方面評估各組大鼠神經(jīng)功能缺損。0分正常，1～6分輕度損傷，7～12分中度損傷，13～18分重度損傷。由不參與動物實(shí)驗的2名研究人員分別進(jìn)行，取平均值。

1.5.2 轉(zhuǎn)棒測試

各亞組采用平衡運(yùn)動轉(zhuǎn)棒儀測試大鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)能力[15-16]。開啟電源，轉(zhuǎn)輪勻速后，將大鼠置于旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)輪上，開始加速，在5 min內(nèi)，將速度從4 r/min加速到40 r/min，如果動物從轉(zhuǎn)輪上脫落或抓住裝置并連續(xù)旋轉(zhuǎn)兩次而不嘗試在轉(zhuǎn)輪上行走，則測試結(jié)束，記錄大鼠在轉(zhuǎn)桿上停留的時間。每天2次，重復(fù)測試3次，每次間隔15 min。動物術(shù)前3 d開始訓(xùn)練，術(shù)前1 d測試作為基線對照值；計算術(shù)后3 d、7 d及14 d測試值與對照值的比值[17-18]。

1.6 Western blotting

神經(jīng)功能評定后，各亞組10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉后斷頭取腦，冠狀位切取缺血側(cè)前囟前后各2 mm腦組織，液氮速凍5 min后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。取適量樣本，加入蛋白裂解液，制成蛋白勻漿；冰上靜置5 min后，4℃12000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白總量。上樣體積20 μl，含蛋白40 μg。

濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%(cIAP1、cleaved-caspase-8)、 13% (cleaved-caspase-3)。SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V,2.5 h)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(80 V,1.5 h)。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加 cleaved-caspase-8(1∶ 500)、 cleaved-caspase-3(1∶500)一抗4℃過夜，加入羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)二抗，37℃孵育45 min。加入cIAP1(1∶100)一抗4℃過2夜，加入驢抗山羊IgG-HRP(1：5000)二抗，37℃孵育2 h。洗膜后ECL發(fā)光液孵育5 min，顯影后拍攝。內(nèi)參β-action(1∶1000)檢測過程同目標(biāo)蛋白。

采用Gel-Pro-Analyzer 4.0分析條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-action條帶灰度值為該樣本目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量，以模型組某一樣本蛋白相對表達(dá)量為1，其余樣本均為與其校正后的相對表達(dá)量[4]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以(±s)表示。采用單因素方差分析，兩兩比較，方差齊者用LSD-t檢驗，不齊者用Tamhane's T2檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評定

2.1.1 mNSS

術(shù)后各時間點(diǎn)，假手術(shù)組mNSS評分均為0；與假手術(shù)組比較，模型組mNSS評分升高(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組mNSS評分降低(P＜0.05)。術(shù)后7 d、14 d，與針刺組、康復(fù)組比較，針康組mNSS評分進(jìn)一步降低(P＜0.05)。見表1。

表1 術(shù)后各時間點(diǎn)各組mNSS評分比較

2.1.2 轉(zhuǎn)棒測試

術(shù)后各時間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，模型組停留時間縮短(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組停留時間均延長(P＜0.05)。術(shù)后7 d、14 d，與針刺組、康復(fù)組比較，針康組停留時間進(jìn)一步延長(P＜0.05)。見表2。

表2 術(shù)后各時間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)棒測試比較

2.2 Western blotting

術(shù)后各時間點(diǎn)，假手術(shù)組可見cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3少量表達(dá)。與假手術(shù)組比較，各時間點(diǎn)模型組cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3表達(dá)升高(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組各時間點(diǎn)cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3表達(dá)降低(P＜0.05)。與針刺組、康復(fù)組比較，術(shù)后7 d、14 d，針康組cleaved-caspase-8表達(dá)進(jìn)一步降低(P＜0.05)。見圖1～圖2、表3～表4。

術(shù)后各時間點(diǎn)，假手術(shù)組可見cIAP1蛋白高表達(dá)。與假手術(shù)組比較，各時間點(diǎn)模型組cIAP1表達(dá)降低(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組各時間點(diǎn)cIAP1表達(dá)升高(P＜0.05)。與針刺組、康復(fù)組比較，術(shù)后7 d、14 d，針康組cIAP1表達(dá)進(jìn)一步升高(P＜0.05)。見圖3、表5。

表3 術(shù)后各時間點(diǎn)各組cleaved-caspase-8蛋白比較

圖1 術(shù)后各時間點(diǎn)各組cleaved-caspase-8蛋白表達(dá)

表4 術(shù)后各時間點(diǎn)各組cleaved-caspase-3蛋白比較

圖2 術(shù)后各時間點(diǎn)各組cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表5 術(shù)后各時間點(diǎn)各組cIAP1蛋白比較

圖3 術(shù)后各時間點(diǎn)各組cIAP1蛋白表達(dá)

3 討論

缺血急性期，缺血中心區(qū)由于突發(fā)血液供應(yīng)中斷，發(fā)生嚴(yán)重細(xì)胞膜離子泵功能障礙及能量代謝衰竭，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡，形成不可逆性腦組織損害；而缺血半暗區(qū)腦組織，由于存在側(cè)支循環(huán)或大動脈殘留血流等原因，細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，具有可逆性。挽救處于休眠狀態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞，對于受損腦組織的結(jié)構(gòu)重塑、神經(jīng)功能的恢復(fù)，具有重要意義。

前期研究證實(shí)[4]，針康法能有效抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善大鼠神經(jīng)功能缺損，優(yōu)于單一的針刺、康復(fù)訓(xùn)練，機(jī)制與其上調(diào)腦缺血后缺血半暗區(qū)XIAP蛋白表達(dá)，抑制caspase-9活化，降低線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究顯示，腦缺血后，大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，存在明顯運(yùn)動協(xié)調(diào)功能障礙；隨著時間延長，大鼠神經(jīng)功能和運(yùn)動障礙有一定程度改善；針康法在促進(jìn)神經(jīng)功能改善的同時，也促進(jìn)大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動功能的恢復(fù)，并在一定時期后，優(yōu)于單一針刺和康復(fù)訓(xùn)練，有一定治療優(yōu)勢。

caspase家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位。caspase-8、caspase-9分別為死亡受體途徑、線粒體凋亡途徑的上游“起始者”，而caspase-3為啟動凋亡發(fā)生的最終“執(zhí)行者”。caspase-8在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中扮演重要角色[10,19-21]：無論是Fas介導(dǎo)通路，還是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)凋亡途徑，最終都激活caspase-8，進(jìn)而活化caspase-3、caspase-6、caspase-7等，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。激活的caspase-8能在胞漿中裂解Bcl-2家族成員Bid，裂解產(chǎn)物的羧基端片段tBid轉(zhuǎn)移到線粒體上，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，啟動caspase-9介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑[22]。這說明無論在細(xì)胞外途徑還是在細(xì)胞內(nèi)途徑中，caspase-8都是關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，活化的caspase-8連接著死亡受體通路與線粒體通路的Cross-talk。

IAP家族是生物發(fā)育和生長過程中廣泛表達(dá)的凋亡抑制因子，其凋亡抑制作用比包括Bcl-2家族在內(nèi)的其他任何家族都要廣泛。它一方面可直接作用于caspase，通過與其相互作用并抑制其活性，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用；另一方面又在調(diào)控凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12,23-24]。有文獻(xiàn)報道[25-26]，cIAP1、cIAP2、XIAP可以通過阻斷細(xì)胞色素C誘導(dǎo)的caspase-9活化，阻止pro-caspase-3、pro-caspase-6、pro-caspase-7的蛋白水解；這些IAP家族成員不能阻止caspase-8誘導(dǎo)的pro-caspase-3蛋白水解活化，但可通過直接抑制活化的caspase-3，中斷下游凋亡事件。另有報道[27]，TNF信號有誘導(dǎo)核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)的能力，而NF-κB的過度表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。

cIAP1/2的抗凋亡活性與其調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答中的NF-κB信號傳導(dǎo)途徑的能力有關(guān)[23]，可觸發(fā)K63自我泛素化和受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1,RIP1)的K11和K63泛素化，導(dǎo)致NF-κB激活和細(xì)胞存活[28]；與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)綁定，促使cIAP1/2與TNF受體反應(yīng)，而與Smac/Diablo的綁定能使Smac與XIAP分離，實(shí)現(xiàn)XIAP對caspases家族成員的抑制[13,29-31]。此外，cIAP1還能對含有RING結(jié)構(gòu)域的cIAP2、XIAP和Livin等IAPs家族成員進(jìn)行調(diào)控，使其經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑降解[30]。

本研究顯示，腦缺血后，cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3持續(xù)高表達(dá)，cIAP1持續(xù)低表達(dá)，提示caspase介導(dǎo)的凋亡途徑在調(diào)控腦缺血后細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，cIAP1表達(dá)缺陷與caspase激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑間存在某種關(guān)聯(lián)。針刺、康復(fù)及針康治療均可有效抑制caspase-8、caspase-3活化介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，解除cIAP1表達(dá)抑制，上調(diào)cIAP1表達(dá)水平，共同抑制caspases介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。腦缺血后7 d、14 d，針康法的這種抗凋亡效應(yīng)優(yōu)于單一針刺、康復(fù)訓(xùn)練。

最近，我們通過免疫熒光雙標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，腦缺血后3 d、7 d、14 d，cIAP1在腦缺血后的神經(jīng)元(NeuN標(biāo)記)、微血管(CD31標(biāo)記)上均存在共表達(dá)，針康法治療可上調(diào)cIAP1在神經(jīng)元、微血管的表達(dá)量，提示cIAP1是介導(dǎo)針康法發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)和血管保護(hù)的共同靶點(diǎn)。

綜上所述，針康法可以改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損，促進(jìn)運(yùn)動協(xié)調(diào)能力恢復(fù)，優(yōu)于單一針刺、康復(fù)訓(xùn)練；其機(jī)制可能與抑制caspase-8、aspase-3蛋白活化，促進(jìn)cIAP1蛋白表達(dá)，從而抑制caspases介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

當(dāng)前，我們尚不能明確腦缺血后cIAP1與caspsae-8、caspase-3存在何種聯(lián)系，cIAP1的缺失是否會反轉(zhuǎn)針康法的抗凋亡作用。下一步我們將采用慢病毒介導(dǎo)的cIAP1基因沉默技術(shù)，進(jìn)一步探討cIAP1在針康法發(fā)揮腦保護(hù)作用中的作用及相關(guān)機(jī)制，為針康法的臨床應(yīng)用奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Winstein CJ,Stein J,Arena R,et al.Guidelines for adult stroke rehabilitation and recovery:a guideline for health care professionals from the American Heart Association/American Stroke Association[J].Stroke,2016,47(6):e98-e169.

[2]唐強(qiáng),朱路文.腦卒中康復(fù)新策略——針康法[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2015,30(10):1071-1073.

[3]唐強(qiáng),姜云飛,朱路文,等.針康法對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血區(qū)堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管抑制素蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(10):1151-1155.

[4]唐強(qiáng),田源,葉濤,等.針康法對腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(12):1365-1371.

[5]唐強(qiáng),葉濤,朱路文,等.針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號通路的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(1):27-31.

[6]葉濤,唐強(qiáng),朱路文,等.針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)皮層血管內(nèi)皮生長因子受體表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(5):520-524.

[7]朱路文,唐強(qiáng),王艷,等.針康法對腦缺血后神經(jīng)血管單元重塑的影響[J].針灸臨床雜志,2016,32(6):70-73.

[8]唐強(qiáng),葉濤,朱路文,等.針康法對局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損及梗死灶周邊區(qū)RhoA、ROCK-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2016,32(8):73-77.

[9]唐強(qiáng),朱路文,邢艷麗,等.針康法對腦缺血大鼠運(yùn)動功能及GAP-43、Nogo-A表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2015,31(1):54-57.

[10]毛德文,陳月橋,王麗,等.Caspase-8及Caspase-3與細(xì)胞凋亡[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,10(10):148-150.

[11]Mohamed MS,Bishr MK,Almutairi FM,et al.Inhibitors of apoptosis:clinical implications in cancer[J].Apoptosis,2017,22(12):1487-1509.

[12]Estornes Y,Bertrand MJ.IAPs,regulators of innate immunity and inflammation[J].Semin Cell Dev Biol,2015,39(3):106-114.

[13]Varfolomeev E,Goncharov T,Vucic D.Roles of c-IAP proteins in TNF receptor family activation of NF-κB signaling[M]//May M.NF-kappa B.Methods in Molecular Biology.New York:Humana Press,2015:269-282.

[14]Koizumi J.Experimental studies of ischemic brain edema.1.A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J stroke,1986,16(8):1-8.

[15]Tsai LK,Wang Z,Munasinghe J,et al.Mesenchymal stem cells primed with valproate and lithium robustly migrate to infarcted regions and facilitate recovery in a stroke model[J].Stroke,2011,42(10):2932-2939.

[16]林冰冰,王鮮,柳維林,等.彌散張量成像觀察電針對缺血性腦卒中大鼠運(yùn)動皮層-紋狀體神經(jīng)傳導(dǎo)束的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(7):756-761.

[17]Zhang QW,Deng XX,Sun X,et al.Exercise promotes axon regeneration of newborn striatonigral and corticonigral projection neurons in rats after ischemic stroke[J].PLoS One,2013,8(11):e80139.

[18]Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.

[19]李花,劉旺華,周小青,等.活血通絡(luò)組方對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)及其抗凋亡機(jī)制研究[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(10):880-883.

[20]夏相宜,肖長江,王宇紅,等.腦健膠囊對MCAO大鼠腦組織Fas凋亡途徑的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,35(1):11-15.

[21]趙瑞杰,李引乾,王會,等.Caspase家族與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國畜牧雜志,2010,46(17):73-78.

[22]Pfeffer CM,Singh AT.Apoptosis:a target for anticancer therapy[J].Int J Mol Sci,2018,19(2):E448.

[23]Gyrd-Hansen M,Meier P.IAPs:from caspase inhibitors to modulators of NF-κB,inflammation and cancer[J].Nat Rev Cancer,2010,10(8):561-574.

[24]Dubrez-Daloz L,Dupoux A,Cartier J.IAPs:more than just inhibitors of apoptosis proteins[J].Cell Cycle,2008,7(8):1036-1046.

[25]Deveraux QL,Roy N,Stennicke HR,et al.IAPs block apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome C by direct inhibition of distinct caspases[J].EMBO J,1998,17(8):2215-2223.

[26]Eckelman BP,Salvesen GS.The human anti-apoptotic proteins cIAP1 and cIAP2 bind but do not inhibit caspases[J].J Biol Chem,2006,281(6):3254.

[27]Figiel I.Pro-inflammatory cytokine TNF-alpha as a neuroprotective agent in the brain[J].Acta Neurobiol Exp(Wars),2008,68(4):526-534.

[28]Berthelet J,Dubrez L.Regulation of apoptosis by inhibitors of apoptosis(IAPs)[J].Cells,2013,2(1):163-187.

[29]Hu S,Yang X.Cellular inhibitor of apoptosis 1 and 2 are ubiquitin ligases for the apoptosis inducer Smac/DIABLO[J].J Biol Chem,2003,278(12):10055-10060.

[30]Cheung HH,Plenchette S,Kern CJ,et al.The RING domain of cIAP1 mediates the degradation of RING-bearing inhibitor of apoptosis proteins by distinct pathways[J].Mol Biol Cell,2008,19(7):2729-2740.

[31]Feltham RL,Moulin M,Vince JE,et al.Tumor necrosis factor(TNF)signaling,but not TWEAK(TNF-like weak inducer of apoptosis)-triggered cIAP1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1)degradation,requires cIAP1 RING dimerization and E2 binding[J].J Biol Chem,2017,292(34):14310.