微流紡海藻酸鹽基纖維敷料的制備及其性能

張小林， 黃 晨， 靳向煜

(東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620)

海藻酸是從天然海藻中提取的一種線性多糖生物高分子聚合物，由β-D-甘露糖醛酸(M單元)和α-L-古羅糖醛酸(G單元)通過1，4-糖苷鍵連接而成的嵌段聚合物[1]。海藻酸因其高生物相容性，無毒性及成凝膠性，被廣泛應(yīng)用于傷口醫(yī)用敷料[2]、藥物釋放[3]及組織工程[4-5]等領(lǐng)域。海藻酸大分子鏈結(jié)構(gòu)中的G單元可與Ca2+交聯(lián)形成特殊的蛋盒結(jié)構(gòu)[6]，相交聯(lián)的鈣離子可與鈉、鉀離子發(fā)生交換[7]形成水溶性的藻酸鹽。海藻酸鈣纖維敷料用于創(chuàng)面治療，可通過離子交換由不溶性海藻酸鈣轉(zhuǎn)變成水溶性海藻酸鈉，吸收大量液體后呈凝膠狀態(tài)，使傷口保持相對安全潤濕的環(huán)境[8]，加速傷口愈合。

目前國內(nèi)研究主要集中于傳統(tǒng)濕法紡絲海藻酸鹽纖維的制備技術(shù)[1]及其性能表征[9]，探索不同濕法紡絲工藝對海藻酸鹽纖維力學(xué)性能、微觀結(jié)構(gòu)和吸濕性能的影響。國外有報(bào)道以海藻酸為原料，通過微流紡或者3D打印技術(shù)，制備藥物微膠囊[10]、組織支架[11]或醫(yī)用敷料[12]，并對其藥物緩釋性能和病理學(xué)進(jìn)行研究。

純海藻酸鹽纖維敷料力學(xué)性能較差，降解過快。如何控制海藻酸鹽纖維的降解速率和力學(xué)性能及開發(fā)新型藻酸鹽纖維仍在探索中。本文在前期研究[7,13]的基礎(chǔ)上，以海藻酸為原料，加入一些無機(jī)材料，通過自制微流紡設(shè)備紡制新型海藻酸鹽復(fù)合纖維敷料。微流紡技術(shù)是一種紡絲技術(shù)，可紡制微米級材料，通過控制流體的成型等而用于制備纖維材料的一項(xiàng)技術(shù)，且紡制過程中涉及到流體學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海藻酸鈉(180947-100G，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)；羥基磷灰石(C10068615，上海麥克林生化科技有限公司)；二氧化硅(C10055745，上海麥克林生化科技有限公司)；氯化鈣(AR500ML，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，胰蛋白酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%)、細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液PBS(Hyclone-SH30256，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Thermo Fisher公司)；人成纖維皮膚細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞(美國模式培養(yǎng)物集存庫)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

S-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立集團(tuán))；XQ-1C型高強(qiáng)高模纖維強(qiáng)伸度儀(上海新纖儀器公司)；D/max-2550VB+/PC型18 kW轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀(日本Rigaku株式會社)；Nicolet 6700型紅外光譜儀、Synergy H1型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；Prodigy型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，美國Leeman公司)；LEICA DMi1型倒置顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.3 海藻酸鹽基纖維敷料制備方法

將海藻酸鈉(SA)高分子原料溶于去離子水(DW)中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的海藻酸鈉溶液3份，標(biāo)記為A、B、C。往A溶液中加入0.1 mg粒徑為(50±5)nm的二氧化硅納米顆粒(SiO2)，B溶液中加入0.1 mg粒徑為(55±5)nm的羥基磷灰石納米顆粒(HAP)。將已配制海藻酸鈉溶液A、B、C分別作為芯層溶液，皮層溶液均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氯化鈣溶液，通過自制微流紡絲設(shè)備[13]紡制3種類型海藻酸鹽基纖維敷料，其成分如表1所示。

表1 3種纖維芯-鞘流成分Tab.1 Core-sheath compositions of three kinds of fiber

1.4 測試方法

1.4.1纖維表面形態(tài)表征

首先使用目測法對海藻酸鹽纖維敷料的外觀形態(tài)進(jìn)行感官評價(jià)，然后采用掃描電子顯微鏡(SEM)對纖維表面形態(tài)進(jìn)一步觀察。

1.4.2纖維化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

采用紅外光譜儀對海藻酸鹽纖維的紅外官能團(tuán)進(jìn)行分析。其測試光譜范圍為4 000～600 cm-1，反射模式，并用衰減全反射光譜法對材料的化學(xué)成分進(jìn)行表征。

1.4.3鈣-鈉元素含量測定

依據(jù)JY/T 015—1996《感耦等離子體原子發(fā)射光譜方法通則》，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測試海藻酸鹽基纖維敷料中鈣-鈉元素含量。

1.4.4體外生物礦化測試

將海藻酸鹽纖維敷料浸漬在模擬體液(SBF)中，30 d后取出纖維，用去離子水沖洗，充分去除纖維表面多余礦物質(zhì)，并用SEM對纖維表面進(jìn)行觀察，并采用X射線衍射儀(XRD)對其進(jìn)行測試分析。

1.4.5生物毒性評價(jià)

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。取3種類型海藻酸鹽纖維各50 mg分別浸漬在50 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，放置在恒溫箱中孵化5 d，將所配制的纖維浸提液取出過濾后備用。

分別將人體皮膚成纖細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞按濃度5 000個(gè)/孔加入到96孔板中，在溫度為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。在培養(yǎng)后的2種細(xì)胞的96孔板中每孔加入100 μL纖維浸提液，空白組加入等體積細(xì)胞完全培養(yǎng)基。然后分別在第1、3、5天取出96孔板，并往孔板中加入10 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h，然后取出孔板并用移液槍吸去孔內(nèi)液體，并在每孔加入100 μL DMSO用于測試，其中測試吸光度為490 nm[14-15]。 然后根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞的相對增殖率：

式中：As為樣品吸光度；Av為空白組吸光度。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。將人體皮膚成纖細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞按照濃度1×106個(gè)/孔接種到3 cm培養(yǎng)板中，于溫度為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿90%后，用20 μL規(guī)格的吸液管分別在培養(yǎng)板中劃痕，并用移液槍吸去培養(yǎng)板中的細(xì)胞完全培養(yǎng)基，然后往培養(yǎng)板中加入3 mL浸提液，空白對照組加入等體積細(xì)胞完全培養(yǎng)基。在固定時(shí)間間隔內(nèi)，取出培養(yǎng)板，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況。

1.4.6纖維溶脹性能與降解性能表征

室溫下將3種纖維敷料分別浸漬在磷酸鹽緩沖液中，在固定時(shí)間間隔內(nèi)取出樣品，用濾紙充分吸除纖維表面多余水分，稱其質(zhì)量變化。用質(zhì)量變化率來表示纖維溶脹性能，其計(jì)算公式為

S=[(ms-mi)/mi]×100%

式中：ms為溶脹后質(zhì)量，g；mi為溶脹前質(zhì)量，g。

在相同處理?xiàng)l件下，在固定時(shí)間間隔內(nèi)取出樣品，充分脫水干燥，稱其質(zhì)量變化。用質(zhì)量損失率來表示纖維降解性能，其計(jì)算公式為

F=[(m0-m1)/m0]×100%

式中：m0為未浸漬前質(zhì)量，g；m1為降解后質(zhì)量，g。

1.4.7力學(xué)性能測試

在溫度為20 ℃，相對濕度為65%條件下，采用高強(qiáng)高模纖維強(qiáng)伸度儀對藻酸鹽基纖維敷料力學(xué)性能進(jìn)行測試，拉伸隔距為10 mm，預(yù)加張力為0.5 cN，拉伸速度為20 mm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維表觀形貌分析

采用掃描電子顯微鏡對紡制的3種纖維敷料表面形態(tài)進(jìn)行觀測，結(jié)果如圖1所示。海藻酸鹽纖維敷料表面較光滑，并無顆粒及孔隙結(jié)構(gòu)，而海藻酸/羥基磷灰石和海藻酸/二氧化硅復(fù)合纖維表面呈現(xiàn)許多圓形顆粒，經(jīng)放大觀察發(fā)現(xiàn)纖維表面存在許多孔隙結(jié)構(gòu)，且嵌入的納米羥基磷灰石和二氧化硅顆粒都均勻地覆蓋在纖維表面，可對纖維吸濕溶脹、降解性能及力學(xué)性能產(chǎn)生一定影響。

圖1 海藻酸鹽基纖維敷料的掃描電鏡照片(×200)Fig.1 SEM images of alginate-based fibrous dressings(×200)

2.2 纖維化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖2 纖維敷料的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of fibrous dressings

2.3 鈣-鈉元素含量分析

為進(jìn)一步證明二氧化硅和羥基磷灰石顆粒的加入阻礙了纖維中Ca2+與溶液中Na+的交換，減緩纖維降解速率，延長降解時(shí)間，故對纖維中鈣-鈉元素含量進(jìn)行測定分析。表2、3分別示出3種纖維敷料中鈉元素和鈣元素含量?？芍w維中鈉元素含量與纖維降解及溶脹速率呈正相關(guān)關(guān)系，而鈣元素含量與降解及溶脹速率呈反相關(guān)關(guān)系。整個(gè)降解過程中，純海藻酸鹽纖維中鈉元素含量最高，鈣元素含量最低，說明該纖維中鈣-鈉離子交換度最大，導(dǎo)致其呈現(xiàn)最大吸濕溶脹度和降解度。反之，海藻酸/羥基磷灰石復(fù)合纖維呈現(xiàn)最小鈉含量及最大鈣含量，對應(yīng)于其最小溶脹度及降解度。

2.4 體外生物礦化研究分析

圖3示出海藻酸/二氧化硅和海藻酸/羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料的礦物沉積圖。由圖1中3種纖維SEM照片可知，海藻酸/二氧化硅及海藻酸/羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料表面呈現(xiàn)許多圓形晶體，這是因?yàn)槎趸璧募尤?，形成的帶正電荷硅酸鈣和模擬體液中負(fù)電荷磷酸根相互作用，最終形成羥基磷灰石沉積在纖維表面。從圖中纖維的XRD圖譜可知，X衍射峰對應(yīng)于羥基磷灰石所屬標(biāo)準(zhǔn)卡片JCPDS # 09-0432。

表2 纖維敷料中鈉元素含量Tab.2 Na content in fibrous dressings

表3 纖維敷料中鈣元素含量Tab.3 Ca content in fibrous dressings

圖3 礦物沉積的XRD圖譜Fig.3 XRD patterns of mineral deposit of fibrous dressings

2.5 細(xì)胞毒性分析

海藻酸鹽纖維敷料作為醫(yī)用衛(wèi)生材料，對細(xì)胞毒性的評價(jià)極其重要。本文采用人體皮膚成纖細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞為研究對象，通過觀察細(xì)胞增殖和遷移情況，來評判材料生物毒性。圖4示出人體皮膚成纖細(xì)胞相對增長率。

圖4 纖維敷料浸提液處理的人體皮膚成纖維細(xì)胞相對增長率Fig.4 Relative growth rate of fibroblasts treated with fibrous dressings extracted medium

圖5示出角質(zhì)化細(xì)胞相對增長率。從圖可知，實(shí)驗(yàn)組OD490均大于空白對照組(編號為CT)，即人體皮膚細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)組浸提液處理后的細(xì)胞存活率大于對照組。海藻酸、海藻酸/二氧化硅和海藻酸/羥基磷灰石纖維敷料所對應(yīng)的成纖細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞相對增長率均大于75%,根據(jù)細(xì)胞毒性評級標(biāo)準(zhǔn)[14-15]可證明材料無生物毒性。

圖5 纖維敷料浸提液處理的人體皮膚角質(zhì)化細(xì)胞相對增長率Fig.5 Relative growth rate of keratinocytes treated with fibrous dressings extracted medium

體外人工模擬劃痕刮傷實(shí)驗(yàn)用于表征材料對皮膚細(xì)胞遷移性能影響，進(jìn)一步評價(jià)纖維敷料的細(xì)胞毒性。成纖細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖6、7所示。

圖6 經(jīng)SA, SA/HAP和SA/SiO2處理過的成纖維細(xì)胞劃痕區(qū)域的遷移結(jié)果Fig.6 Fibroblast migration in scratched fibroblast free area after treated with SA, SA/HAP and SA/SiO2 extracted medium incubated for 1, 3 and 5 d

圖7 經(jīng)SA, SA/HAP和SA/SiO2處理過的角質(zhì)化細(xì)胞劃痕區(qū)的遷移結(jié)果Fig.7 Keratinocyte migration in scratched keratinocyte free area after treated with SA, SA/HAP and SA/SiO2 extracted medium incubated for 1, 3 and 5 d

由圖6可知，經(jīng)3種纖維敷料浸提液處理過的成纖細(xì)胞刮傷劃痕，24 h 后長滿90%，48 h后基本全部長滿。圖7顯示，纖維敷料浸提液處理的角質(zhì)化細(xì)胞刮傷劃痕區(qū)48 h后長滿70%，72 h后長滿90%。實(shí)驗(yàn)組人體皮膚成纖細(xì)胞及角質(zhì)化細(xì)胞遷移速率和空白對照組相同，由此可知，本文紡制的海藻酸鹽基纖維敷料對皮膚細(xì)胞無細(xì)胞毒性。

2.6 溶脹性能與降解性能分析

圖8示出3種纖維敷料的溶脹度及降解度。

圖8 纖維敷料的溶脹度和降解度Fig.8 Swelling behavior (a) and degradation performance (b) of fibrous dressings

由圖可知，純海藻酸鹽纖維比海藻酸/二氧化硅及海藻酸/羥基磷灰石復(fù)合纖維呈現(xiàn)出較大的溶脹性能、較快的降解速率。海藻酸鹽纖維中含有大量的—OH和—COOH，其浸漬在磷酸鹽緩沖液中時(shí)，纖維大分子鏈中β-D-甘露糖醛酸(M)基團(tuán)吸收大量水分，當(dāng)達(dá)到其飽和狀態(tài)時(shí)，纖維發(fā)生部分降解；此時(shí)α-L-古羅糖醛酸(G)大分子基團(tuán)蛋盒結(jié)構(gòu)中與—COOH交聯(lián)的Ca2+和溶液中的Na+發(fā)生離子交換，吸收更多水分，最終導(dǎo)致“蛋盒”破裂，大量水分子進(jìn)入到大分子鏈中，纖維發(fā)生降解[7]，因此，其降解速率較大。海藻酸/羥基磷灰石復(fù)合纖維呈現(xiàn)較低的溶脹和降解性能，這是因?yàn)榧尤氲牧u基磷灰石顆粒覆蓋在纖維表面，阻礙了水分子浸入內(nèi)部，使纖維溶脹性能變差，從而降低纖維降解速率。海藻酸/二氧化硅復(fù)合纖維中加入的二氧化硅和溶液中的Ca2+形成硅酸鈣鹽。當(dāng)纖維浸漬在磷酸鹽緩沖液中，帶正電荷的硅酸鈣和帶負(fù)電荷的磷酸離子相互作用，最終以磷灰石沉淀沉積在纖維表面，從而降低纖維溶脹及降解性能。

2.7 力學(xué)性能分析

纖維初始斷裂伸長率及斷裂應(yīng)力如表4所示?？煽吹剑杭兒Ｔ逅猁}纖維斷裂應(yīng)力最小，斷裂伸長率最大，而含有無機(jī)納米顆粒的纖維呈現(xiàn)出較大的斷裂應(yīng)力及較小斷裂伸長。納米顆粒的加入，可減少纖維弱節(jié)點(diǎn)，同時(shí)增加纖維剛度。另外，纖維力學(xué)性能隨降解時(shí)間的延長而逐漸下降，3種纖維敷料的斷裂伸長率和斷裂應(yīng)力均隨著時(shí)間增加而減弱，且纖維降解速率越快，斷裂伸長率和斷裂應(yīng)力損耗越大。海藻酸/二氧化硅及海藻酸/羥基磷灰石復(fù)合纖維在降解過程中有羥基磷灰石沉積在纖維表面，使降解速率減小，纖維剛度增強(qiáng)，最終導(dǎo)致纖維呈現(xiàn)較大斷裂應(yīng)力和較小斷裂伸長率。

表4 3種纖維敷料的斷裂伸長率和斷裂應(yīng)力Tab.4 Elongation at break and breaking stress of fibrous dressings

3 結(jié) 論

與純海藻酸鹽纖維敷料相比，海藻酸鹽/羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料及海藻酸鹽/二氧化硅復(fù)合纖維敷料的降解度下降20%左右，斷裂應(yīng)力約增加18%。由此可知，芯層流中加入納米二氧化硅和羥基磷灰石顆?？山档筒牧辖到馑俾剩泳彶牧辖到庵芷?，改善其力學(xué)性能。另外，無機(jī)納米顆粒的嵌入使得纖維敷料表面呈現(xiàn)孔隙結(jié)構(gòu)，有益于營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸及組織再生長。由人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，皮膚細(xì)胞在纖維敷料浸提液中可維持正常活性如增殖、遷移等，即本文紡制的海藻酸鹽基纖維敷料無細(xì)胞毒性。

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