降鈣素基因相關(guān)肽和腺苷2A受體在偏頭痛模型大鼠中的表達(dá)及作用機(jī)制*

母發(fā)光 鄒撰 周超然 歐陽(yáng)穎

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

偏頭痛是一種慢性中樞神經(jīng)血管性疾病，由于生活環(huán)境逐漸改變及精神壓力增大等因素，偏頭痛的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，并可能?chē)?yán)重影響患者工作和生活質(zhì)量。但目前該病發(fā)病機(jī)制尚未完全研究清楚[1]。三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)在當(dāng)今學(xué)術(shù)界對(duì)偏頭痛的研究中占主導(dǎo)地位，降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)主要是由三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)末梢分泌、釋放。它是目前所知最強(qiáng)的內(nèi)源性舒血管物質(zhì)，CGRP水平與偏頭痛發(fā)作明確相關(guān)[2]。腺苷是一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，它的受體(adenosine receptor，AR)包括四種亞型，即為A1R、A2AR、A2BR、A3R。其中，A2AR與偏頭痛的關(guān)系最為密切，不同類(lèi)型的偏頭痛患者的A2AR基因分析，證實(shí)該基因的變異可能與偏頭痛的發(fā)生有關(guān)。A2AR激活后可促進(jìn)神經(jīng)元CGRP的釋放，還能增強(qiáng)CGRP對(duì)神經(jīng)突觸間興奮傳遞的易化作用[3]。硝酸甘油(Nitroglycerin,NTG)偏頭痛模型大鼠與人類(lèi)偏頭痛發(fā)作的臨床表現(xiàn)相近，是目前研究偏頭痛發(fā)生機(jī)制常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[4]。故本研究通過(guò)建立硝酸甘油(nitroglycerin,NTG)偏頭痛模型大鼠，檢測(cè)CGRP及A2AR在模型大鼠三叉神經(jīng)組織中的表達(dá)，以探討偏頭痛的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 熒光顯微鏡(日本 Nikon 公司)；X射線(xiàn)攝行暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械廠(chǎng))；電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad 公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析儀(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：H11020289)，CGRP受體抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：bs-10639R)，A2A受體抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，產(chǎn)品批號(hào)：byk-1456R)，BCA蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：P0010S)，細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：P0033)4%多聚甲醛(博士德生物工程有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：AR1068)，四甲基乙二胺(TEMED)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：023k0016)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制備 清潔級(jí)健康SD雄性大鼠30只，平均體重200±20克，雌雄各半。由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格許可證號(hào)：SYXK(川)2008-110。自由飲食，分籠喂養(yǎng)。將所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組,每組各10只。模型組按TassorelliCristina法[5]在大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油(NTG)10mg/Kg，空白對(duì)照組則生理鹽水(NS)10ml/Kg皮下注射，每周注射1次，共5周。注射N(xiāo)TG約數(shù)分鐘的大鼠表現(xiàn)出極度的煩躁不安，并出現(xiàn)耳朵發(fā)紅、搔頭、攀爬鼠籠的次數(shù)增加甚至咬尾等行為，這些行為約持續(xù)3～5小時(shí)后逐漸消退，大鼠繼而出現(xiàn)蜷臥，活動(dòng)明顯減少?？瞻讓?duì)照組則僅在注射N(xiāo)S后數(shù)分鐘內(nèi)表現(xiàn)為煩躁不安隨后恢復(fù)平靜，無(wú)耳紅、搔頭等現(xiàn)象出現(xiàn)。對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，總分達(dá)6分或以上的可視為造模成功[6,7]。

1.2.2 標(biāo)本的采集和處理 兩組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分后，對(duì)大鼠予以10%水合氯醛3ml/kg經(jīng)大鼠腹部注入體內(nèi)，等待數(shù)分鐘將大鼠完全麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，開(kāi)顱剝?nèi)ケ砻娴挠材X膜，將大腦組織翻起，暴露顱底的三叉神經(jīng)節(jié)，取三叉神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)頸復(fù)合體部分放入 4% 多聚甲醛中固定，4℃保存；另一部組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)方法

1.2.3.1 HE染色檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu) 取出固定液中的三叉神經(jīng)節(jié)組織，依次置于不同濃度的乙醇中脫水，脫水后的將組織用石蠟包埋后制成厚度約5μm的切片。切片經(jīng)脫蠟、水化，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分色，氨水返藍(lán)，脫水，中性樹(shù)脂封片。最后在100和400倍光鏡下觀(guān)察切片中三叉神經(jīng)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.3.2 免疫組化檢測(cè)CGRP的表達(dá) 將三叉神經(jīng)節(jié)標(biāo)本,從4%多聚甲醛固定液中取出，脫水，石蠟包埋，切片,將其平展貼于硌礬明膠處理過(guò)的載玻片上。作免疫組化時(shí)，脫蠟,水化,封閉,修復(fù)。滴加兔抗大鼠(CGRP抗體，一抗，1:200)，滴加生物素羊抗兔(二抗，1:200)50μl/切片，滴加約50μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素。DAB顯色，封片。最后把制作好的玻片放在×400光鏡下觀(guān)察、采圖(如組圖6)，并使用Image-pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)上對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析，以分泌CGRP的陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(OD)來(lái)表示CGRP的分布及含量。

1.2.3.3 免疫熒光檢測(cè)A2AR的表達(dá) 標(biāo)本制片、水化，滴加山羊血清封閉，加入 1:2000 的A2AR兔多克隆抗體，滴加用FITC標(biāo)記稀釋(1：100)后的羊抗兔IgG(二抗)，充分反應(yīng)后封片；將制作好的載玻片放于熒光顯微鏡下用OLYMPUS BX51 觀(guān)察拍片，同時(shí)用PBS做背景對(duì)照，在鏡下表達(dá)A2AR的陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，用藍(lán)色熒光染料DAPI特異與神經(jīng)元DNA結(jié)合,明確組織中的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)及分布情況與表達(dá)綠色的A2AR的陽(yáng)性細(xì)胞作對(duì)照，最后在×200鏡下記錄每個(gè)標(biāo)本的表達(dá)A2AR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，見(jiàn)圖3。

1.2.3.4 Western blot檢測(cè)A2ARD的表達(dá) 取出液氮中的組織樣本，研缽中攆碎后，用預(yù)冷的PBS溶液洗2次；加入10ul/100mg組織蛋白裂解液，再加入lml/l00mg的PMSF，分裝于EP管；置于在冰浴中30min充分裂解蛋白，震蕩儀震蕩混勻；4℃下 11000轉(zhuǎn)/分，離心10-20min，將上清液分裝于0.5ml EP管中，行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)及顯色。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次后，使用Quantity One圖像分析軟件測(cè)量條帶的光密度值，A2ARD的相對(duì)表達(dá)豐度則以靶蛋白灰度/β-actin灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，符合正態(tài)分布資料以±s表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三叉神經(jīng)節(jié)組織HE染色結(jié)果 模型組和對(duì)照組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織HE染色后光鏡下不同倍數(shù)的對(duì)照比較，兩組均顯示神經(jīng)元與神經(jīng)纖維分布正常、無(wú)紊亂，解剖結(jié)構(gòu)完整，無(wú)異常改變。提示：模型偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)沒(méi)有發(fā)生明顯器質(zhì)性病變，其行為改變可能是功能性的異常引起，見(jiàn)圖1。

圖1 三叉神經(jīng)組織HE染色Figure 1 HE staining of trigeminal ganglion

2.2 兩組大鼠三叉神經(jīng)組織中A2AR表達(dá)

2.2.1 Western-blot檢測(cè)結(jié)果模型組與對(duì)照組A2AR蛋白表達(dá)，模型組A2AR蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組。模型組灰度值高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.2.2 三叉神經(jīng)組織中A2AR表達(dá)Western-blot蛋白定量灰度值測(cè)定結(jié)果，對(duì)照組為(59.48±5.58)%，模型組為(145.96±8.45)%，兩組比較，P<0.01。

2.2.3 三叉神經(jīng)組織中A2AR表達(dá)蛋白免疫熒光測(cè)定結(jié)果 表示神經(jīng)細(xì)胞中的DNA分布(藍(lán)色熒光)情況，綠色熒光部分則表示A2AR在三叉神經(jīng)各神經(jīng)元中的表達(dá)分布情況。對(duì)比觀(guān)察兩組綠色熒光部分發(fā)現(xiàn)：模型組中的A2AR蛋白所代表的綠色熒光部分面積明顯大于對(duì)照組，見(jiàn)圖3。

圖2兩組三叉神經(jīng)節(jié)中A2AR蛋白表達(dá)的Western-blot結(jié)果

Figure2Theresultofwestern-blottotestexpressionofA2ARinthetwogroups

圖3 免疫熒光檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中A2AR蛋白表達(dá)情況(n=10,標(biāo)尺均為40μm)Figure 3 The expression of A2AR protein in immune fluorescence detection in rat trigeminalganglion

2.2.4 通過(guò)免疫熒光記錄兩組三叉神經(jīng)節(jié)上A2AR陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)及CGRP的OD值比較模型組A2AR陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，模型組明顯高于對(duì)照組P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組CGRP的OD值明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.3 三叉神經(jīng)組織中CGRP含量免疫組織化學(xué)測(cè)定(SP法)結(jié)果 光鏡觀(guān)察顯示對(duì)照組中神經(jīng)元中CGRP含量少，密度低；模型組中CGRP分布豐富，密度高，見(jiàn)圖4。

表1兩組三叉神經(jīng)節(jié)A2AR陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)及CGRP的OD值比較

Table1ThenumberofA2ARpositiveneuronsintrigemianlganglionindifferentgroups

組別nA2AR細(xì)胞數(shù)CGRP/OD對(duì)照組1535.73±3.680.15±0.022模型組1577.64±3.93*0.41±0.027t30.1527.23PP<0.01P<0.01

圖4 兩組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP分布情況Figure 4 The distribution of CGRP in trigeminal ganglion of rats in each group(IHC,×400，bar=50μm)注：免疫組化，×400，箭頭所示為CGRP所分布的神經(jīng)元，標(biāo)尺=50μm

3 討論

偏頭痛是一種臨床常見(jiàn)的具有明顯家族聚集性的血管-神經(jīng)性頭痛，發(fā)作時(shí)為單側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)性頭痛且發(fā)作頻繁。其的發(fā)作機(jī)理仍不明確。三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)主要是指中樞血管強(qiáng)烈擴(kuò)張時(shí)，經(jīng)過(guò)一系列病理生理過(guò)程，最終導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥，進(jìn)而引起偏頭的發(fā)作[1.8]。硝酸甘油在體內(nèi)分解成一氧化氮(NitrcOxide,NO)。NO能激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)腺昔酸環(huán)化酶,使環(huán)鳥(niǎo)苷酸增高,松弛血管平滑肌和使血管舒張,產(chǎn)生即發(fā)性頭痛反應(yīng),激發(fā)三叉神經(jīng)一血管反射,誘導(dǎo)C-fos的表達(dá),產(chǎn)生遲發(fā)性頭痛反應(yīng),人類(lèi)偏頭痛的各種臨床癥狀投影到偏頭痛模型大鼠身上則表現(xiàn)為用前肢抓撓頭、耳紅、咬尾、攀籠、來(lái)回走動(dòng)等行為[9]。本研究中模型組按在大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油(NTG)每周注射1次，5周后出現(xiàn)以上發(fā)作。說(shuō)明模型制作是成功的。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空白組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織HE染色后光鏡下不同倍數(shù)的對(duì)照比較，兩組均顯示神經(jīng)元與神經(jīng)纖維分布正常、無(wú)紊亂，解剖結(jié)構(gòu)完整，無(wú)異常改變。提示：模型偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)沒(méi)有發(fā)生明顯器質(zhì)性病變，其行為改變可能是功能性的異常引起。

研究偏頭痛相關(guān)活性物質(zhì)表達(dá)有助于探究發(fā)病機(jī)制及藥物研發(fā)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CGRP和A2AR兩種活性物質(zhì)在偏頭痛發(fā)病過(guò)程中的變化是研究的熱點(diǎn)。A2AR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)中，它主要是通過(guò)與不同種類(lèi)的G蛋白或蛋白激酶相偶聯(lián)，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)[10]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱鞒晒?，三叉神?jīng)節(jié)中A2AR蛋白表達(dá)的Western-blot量及灰度值、免疫熒光測(cè)定、A2AR陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果：模型組A2AR表達(dá)量明顯高于對(duì)照組大鼠。說(shuō)明A2AR參與了偏頭痛的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。它可能參與偏頭痛的作用機(jī)制是：①可以直接介導(dǎo)促進(jìn)興奮性氨基酸的釋放，提高神經(jīng)敏感性，誘發(fā)偏頭痛；②與G蛋白(Gs)相偶聯(lián)使腺苷環(huán)化酶(AC)活性增高，促進(jìn)cAMP蛋白合成，激活蛋白激酶A(PKA)或激活Ras/Raf-1/MEK/ERK的信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起硬腦膜血管擴(kuò)張；③位于大腦皮層突觸前的A2AR激活后可抑制L、N型Ca2+通道，抑制Ca2+的內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，進(jìn)而可增加興奮性氨基酸的釋放,增強(qiáng)膜的去極化作用使神經(jīng)元興奮性升高，舒張血管平滑肌,引起偏頭痛[11]。

CGRP它具有介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)第二信使c-AMP的作用，目前已知c-AMP的升高程度與血管舒張反應(yīng)的強(qiáng)弱強(qiáng)度密切相關(guān)，是目前已知腦循環(huán)中作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管舒張肽，是三叉神經(jīng)微循環(huán)激活中的標(biāo)志物質(zhì)[12]。三叉神經(jīng)節(jié)CGRP免疫組化表達(dá)水平及OD值結(jié)果：模型組CGRP及OD值的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。說(shuō)明CGRP也參與了偏頭痛的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。它誘導(dǎo)偏頭痛發(fā)生的作用機(jī)制主要包括以下幾方面：①三叉神經(jīng)末梢釋放的CGRP激活神經(jīng)元中的N、P型電壓敏感性鈣離子通道促進(jìn)Ca2+內(nèi)流或細(xì)胞膜對(duì)Ca2+的通透性，直接引起硬腦膜血管的劇烈擴(kuò)張[13,14]。鈣離子通道阻滯劑能夠有效抑制腦細(xì)胞內(nèi)的鈣離子釋放與異常的鈣離子內(nèi)流，舒張血管與平滑肌, 從而解除血管與平滑肌痙攣, 最終達(dá)到止痛的目的。②CGRP刺激與其鄰近的肥大細(xì)胞，促使肥大細(xì)胞脫顆粒作用，繼而誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥。除此之外肥大細(xì)胞還可以釋放出多種如前列腺素、組胺5-HT等的神經(jīng)血管活性物質(zhì)，此過(guò)程就如一種正反饋機(jī)制引起CGRP在神經(jīng)元中的持續(xù)釋放，從而引起偏頭痛的長(zhǎng)期發(fā)作[15]。5-HT 受體拮抗藥,作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和三叉神經(jīng)中受體介導(dǎo)的神經(jīng)通路, 逆轉(zhuǎn)偏頭痛發(fā)作時(shí)血中CGRP的增加。通過(guò)阻斷神經(jīng)源性炎癥起到治療偏頭痛的作用。③大量的CGRP 受體存在衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中,促進(jìn)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞激活和提高其致敏的作用，同時(shí)會(huì)有利于CGRP 本身的合成和釋放，進(jìn)一步提高和維持神經(jīng)敏感性和炎癥狀態(tài)[16]。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠偏頭痛發(fā)作時(shí)，三叉神經(jīng)節(jié)中A2AR的蛋白表達(dá)量和CGRP的含量均升高，提示A2AR和CGRP兩者之間量的變化趨勢(shì)一致。大量的研究證實(shí)在海馬CAl區(qū)使用CGRP刺激興奮性突觸后電位并未發(fā)生變化,而當(dāng)應(yīng)用A2AR激動(dòng)劑后，發(fā)現(xiàn)興奮性突觸后電位較前明顯升高,而此時(shí)再加入A2AR抑制劑后，興奮性突觸后電位被明顯抑制[17,18]。阻斷A2AR或者利用腺苷水解酶清除細(xì)胞外腺苷都將會(huì)阻斷CGRP對(duì)神經(jīng)突觸的興奮性傳遞作用[19,20]。說(shuō)明A2AR可能促進(jìn)大腦血管周?chē)嫔窠?jīng)CGRP的釋放及增強(qiáng)CGRP的神經(jīng)突觸傳遞作用,共同導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)作。

4 結(jié)論

本文資料提示,兩組大鼠三叉神經(jīng)組織無(wú)解剖結(jié)構(gòu)上的改變，大鼠行為學(xué)改變與三叉神經(jīng)功能異常有關(guān)。表現(xiàn)為A2AR的激活或蛋白上調(diào)，CGRP大量釋放，A2AR和CGRP兩者之間量的變化趨勢(shì)一致。A2AR、CGRP可能在偏頭痛的發(fā)作中發(fā)揮重要作用。

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