ALDH2對大鼠心肌缺血/再灌注損傷與凋亡的影響及機(jī)制的研究

楊麗，張俊峰，楊文龍，張?zhí)锾?/p>

心肌缺血/再灌注損傷（IRI）是指缺血心肌恢復(fù)血流再灌注后，反而加重其結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，梗死范圍擴(kuò)大，造成心功能進(jìn)一步損害[1]。其損傷程度可影響缺血性心臟病的治療和預(yù)后[2]。以往認(rèn)為心肌缺血/再灌注損傷所致的心肌細(xì)胞死亡是壞死，近來研究提示尚有凋亡參與IRI的形成[3,4]。

目前關(guān)于缺血/再灌注損傷的機(jī)制尚不明確，多數(shù)學(xué)者支持氧化應(yīng)激學(xué)說。乙醛脫氫酶2（ALDH2）是體內(nèi)重要的酶。目前關(guān)于ALDH2激動劑預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷細(xì)胞凋亡以及通路影響的研究較少。本研究旨在觀察應(yīng)用ALDH2激動劑促進(jìn)ALDH2高表達(dá)后，大鼠心肌缺血/再灌注損傷中Bcl-2、Bax和細(xì)胞凋亡的變化，并探討ALDH2是否通過JNK通路抑制凋亡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性成年SD大鼠40只，體重（220±20）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為：①假手術(shù)組：冠狀動脈左前降支暴露后關(guān)閉切口；②激動劑（乙醇）+假手術(shù)組：術(shù)前3 h，腹腔注射5%乙醇（1 g/kg）之后，暴露冠狀動脈左前降支，并關(guān)閉切口；③缺血/再灌注組：暴露冠狀動脈左前降支，并結(jié)扎30 min模擬局部心肌缺血，而后松結(jié)扎線，并恢復(fù)灌流2 h；④激動劑（乙醇）+缺血/再灌注組：同缺血/再灌注組，但在術(shù)前3 h，腹腔注射5%乙醇（1 g/kg）。

1.2 主要試劑及儀器 羊抗ALDH2單克隆抗體、鼠抗Bcl-2、Bax單克隆抗體、鼠抗JNK、P-JNK單克隆抗體購自Santa公司，GAPDH購自Abcam公司。ALDH2兔抗羊二抗、Bcl-2、Bax兔抗鼠二抗、JNK、P-JNK兔抗鼠二抗購自Santa公司。TUNEL試劑盒購自Roche公司；蛋白酶K購自Roche公司；倒置熒光顯微鏡（Nikon Eclipse Ti-SR）；電泳儀（型號EPS-600， 上海天能科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3 動物模型制作 大鼠術(shù)前禁食8 h，然后經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液0.1 ml/100 g，麻醉后固定于手術(shù)臺，頸、胸部備皮，應(yīng)用碘伏消毒，頸部縱行切口，仔細(xì)分離皮下組織及肌肉，顯露氣管，行氣管插管并連接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率和通氣量。于胸骨左緣3 mm處剪開胸部皮膚約4 cm，鈍性分離皮下組織、胸大肌與前鋸肌，撐開肌肉，顯露肋骨、肋間肌，于第三肋間隙逐步剪開，顯露并撕破心包，可見心臟，探查確定左心耳，確定縫扎位置（肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2 mm，前降支LAD近端位置），0號線結(jié)扎LAD，缺血30 min，松開結(jié)扎，復(fù)灌2 h。每組隨機(jī)抽取5只用于心肌梗死面積測定，另外5只取左心室用于心肌組織蘇木精-伊紅（HE）染色，Western blot測定ALDH2、JNK、p-JNK、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4 心肌梗死面積計算 將左心室切成厚度3～4 mm的薄片3片，置于避光的1% TTC染液中。置入37℃恒溫箱20 min，使均勻染色，去離子水沖洗干凈，非梗死區(qū)心肌染色呈深紅色，心肌梗死區(qū)為灰白色。應(yīng)用Image J軟件測量并統(tǒng)計每塊梗死心肌占全部左心室心肌面積的百分比。

1.5 HE染色鏡檢 將取下的部分心肌置于甲醛中依次固定、脫水、石蠟包埋，制成5 μm的切片，行HE染色，隨機(jī)選取切片5張，應(yīng)用顯微鏡觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。由1名不了解分組情況的觀察者獨立完成鏡檢并采集圖片。

1.6 Western blot測心肌ALDH2、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量 將各組心肌組織勻漿，高速離心后，測定并調(diào)整蛋白濃度，制備電泳樣品，每孔上樣20 μl。電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h。一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。隨后根據(jù)用量，按照1:5000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1 h。ECL發(fā)光液加在膜的正面暗室避光5 min。暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.7 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 組織切片、脫蠟后，加入2 μg/ml蛋白酶K，37℃孵育30 min；然后滴加破膜工作液，孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。按切片數(shù)量和組織大小取Tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）混合覆蓋組織，37℃孵育2 h。每張切片滴加轉(zhuǎn)化物POD（蓋過組織即可），疏水膜覆蓋，濕盒中恒溫37℃反應(yīng)30 min；取出后PBS液沖洗2 min，重復(fù)3次。每張切片滴加DAB應(yīng)用液50 μl，室溫染色10 min；取出后PBS液沖洗2 min，重復(fù)3次。每張切片滴加蘇木素1滴，染色10 min，蒸餾水沖洗30 s；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，鏡檢。每個標(biāo)本計數(shù)8個高倍鏡（×400）視野內(nèi)的所有陽性細(xì)胞個數(shù)和所有細(xì)胞數(shù)，求其比值。每張切片由2名觀察者分別讀片得出。計算公式：

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用SNK檢驗，相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌梗死比較 缺血/再灌注組和激動劑+缺血/再灌注組均可見心肌梗死區(qū)，缺血/再灌注組心肌梗死比例較激動劑+缺血/再灌注組明顯增大，（52.51±7.12）%vs. （24.10±5.37）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），（圖1）。

圖1 各組心肌組織TTC染色

2.2 各組心肌組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組和激動劑+假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯萎縮、肥大或壞死。心肌細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核致密。缺血/再灌注組大鼠心肌纖維排列紊亂，間質(zhì)水腫，組織間隙明顯增寬，心肌細(xì)胞多處腫脹、溶解斷裂，發(fā)生空泡樣變性，細(xì)胞核腫脹，甚至消失；而激動劑+缺血/再灌注組的心肌損傷較輕，可見心肌纖維結(jié)構(gòu)尚完整，輕度水腫，組織間隙輕度增寬，心肌細(xì)胞排列尚整齊，部分核染色呈深染改變（圖2）。

2.3 各組心肌ALDH2、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 缺血/再灌注組、激動劑+缺血/再灌注組、假手術(shù)組和激動劑+假手術(shù)組ALDH2表達(dá)分別為（25.28±3.92）、（37.42±7.27）、（100.0±0.00）、（116.83±5.61），前兩組低于后兩組，且缺血/再灌注組ALDH2表達(dá)低于激動劑+缺血/再灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。缺血/再灌注組Bcl-2蛋白表達(dá)較激動劑+缺血/再灌注組降低[（22.24±3.20）vs. （32.04±4.86）]，Bax表達(dá)較激動劑+缺血/再灌注組升高[（131.88±16.88）vs. （114.50±5.15）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。缺血/再灌注組Bcl-2/Bax比值較激動劑+缺血/再灌注組降低 [（0.17±0.04）vs. （0.28±0.05）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。四組均可測得JNK、p-JNK蛋白表達(dá)，缺血/再灌注組JNK蛋白表達(dá)高于激動劑+缺血/再灌注組[（193.03±3.98）vs.（154.17±9.82）]，p-JNK表達(dá)也高于激動劑+缺血/再灌注組[（229.16±11.17）vs. （165.57±9.30）]，p-JNK/JNK比值高于激動劑+缺血/再灌注組[（1.20±0.05）vs. （1.10±0.04）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（圖3）。

圖2 各組心肌組織HE染色

2.4 各組心肌凋亡結(jié)果比較 四組均可觀察到凋亡的細(xì)胞。缺血/再灌注組和激動劑+缺血/再灌注組細(xì)胞凋亡率均高于假手術(shù)組和激動劑+假手術(shù)組，[（38.36±9.08）%、（16.33±2.29）%vs.（4.76±1.41）%、（5.19±0.62）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。缺血/再灌注組細(xì)胞凋亡率高于激動劑+缺血/再灌注組（圖4）。

圖3 各組心肌組織ALDH2、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

2.5 心肌ALDH2、JNK表達(dá)量及凋亡率的相關(guān)性分析 四組大鼠左心室ALDH2表達(dá)量與凋亡率呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為-0.799，P＜0.01）；ALDH2表達(dá)量與p-JNK/JNK呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為-0.752，P＜0.01）。

圖4 各組心肌組織TUNEL染色

3 討論

目前國內(nèi)心血管疾病的發(fā)病人數(shù)逐年增加，隨著經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)，冠狀動脈內(nèi)支架置入術(shù)、冠狀動脈旁路移植術(shù)以及溶栓治療等的廣泛應(yīng)用，缺血性心臟病的治療取得了顯著進(jìn)展[5]。而心肌缺血/再灌注損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，增加心肌梗死面積[6]，這也成為缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的首要難題[7]。

缺血/再灌注損傷病理機(jī)制比較復(fù)雜，大多數(shù)研究認(rèn)為是多種因素、多種途徑共同作用的結(jié)果。大多數(shù)學(xué)者支持氧化應(yīng)激學(xué)說。氧化應(yīng)激過程中，自由基的過度生成會導(dǎo)致組織內(nèi)氧化/還原平衡紊亂，過多的自由基將使細(xì)胞DNA解鏈和脂質(zhì)過氧化等，從而引起蛋白的失活等。氧化應(yīng)激可破壞相關(guān)酶活性及破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和死亡，加重組織損傷。

乙醛脫氫酶2（ALDH2）是體內(nèi)乙醇代謝的重要醛類氧化酶，可阻止乙醛及其代謝產(chǎn)物對膜的脂質(zhì)過氧化，ALDH2是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激的保護(hù)因子。ALDH2在心、腦、肝臟等組織中表達(dá)豐富，參與了各種內(nèi)源性、外源性脂肪及芳香族醛類物質(zhì)代謝或解毒過程，對氧化應(yīng)激起到防護(hù)作用[7]。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶2可減輕缺血心肌的氧化應(yīng)激。本實驗觀察到在大鼠心肌缺血/再灌注損傷前應(yīng)用ALDH2激動劑乙醇，心肌梗死面積減少，病理改變減輕，心肌組織ALDH2增高，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值升高，細(xì)胞凋亡降低。說明促進(jìn)ALDH2高表達(dá)后，抑制細(xì)胞凋亡，缺血/再灌注損傷減輕。

c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族中重要的通路之一，存在于多種生命活動過程中并且容易受多種細(xì)胞外應(yīng)激因素激活并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。JNK介導(dǎo)體內(nèi)多種細(xì)胞的凋亡，并參與凋亡。目前認(rèn)為JNK介導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要有兩種[10]：一是轉(zhuǎn)錄因子途徑，是指通過轉(zhuǎn)錄方式調(diào)節(jié)下游調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄和凋亡蛋白的表達(dá)而介導(dǎo)死亡受體途徑和線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。如活化的JNK由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，激活相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白、ATF-2等，誘導(dǎo)FasL、TNF等死亡配體的表達(dá)，啟動死亡受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]，進(jìn)入細(xì)胞核的活化JNK，激活相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子后可誘導(dǎo)BH3-only蛋白的表達(dá)，然后活化Bax等促凋亡蛋白，進(jìn)入線粒體，破壞線粒體膜的通透性，引起細(xì)胞凋亡；二為非轉(zhuǎn)錄因子途徑。在JNK活化過程中，部分活化的JNK留在了細(xì)胞質(zhì)中，未進(jìn)入細(xì)胞核，這部分活化的JNK通過磷酸化作用直接作用于Bcl-2家族，調(diào)節(jié)它們活性而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，此過程沒有新基因的表達(dá)[12]。

Bcl-2是目前公認(rèn)有抑制細(xì)胞凋亡作用的因子[13]。Bcl-2和Bax表達(dá)量對細(xì)胞凋亡起重要作用[14,15]。當(dāng)Bcl-2表達(dá)增高時，可形成Bcl-2-Bax異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡；相反，當(dāng)Bax表達(dá)增高時，可形成Bax/Bax同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。故Bcl-2和Bax的比值可反映細(xì)胞受刺激后是凋亡還是存活。結(jié)合本實驗，在激動劑+缺血/再灌注組和缺血/再灌注組觀察到的Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比值變化，考慮JNK可能通過上述兩種機(jī)制參與細(xì)胞凋亡發(fā)生。

本研究推測，高表達(dá)ALDH2可減輕心肌缺血/再灌注損傷，可能通過抑制JNK、p-JNK蛋白表達(dá)增加，減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。為臨床上心肌缺血/再灌注損傷預(yù)防和治療提供新的思路。

參 考 文 獻(xiàn)

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